鯉生長速率性狀的QTL定位分析

張曉峰，李超，魯翠云，鄭先虎，匡友誼，曹頂臣，孫效文

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，農業(yè)農村部淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

提高生長速率可以縮短飼養(yǎng)時間，降低生產成本，增加養(yǎng)殖經濟效益[1]，是水產育種的重要經濟性狀之一。生長速率性狀是由多基因控制的數量性狀[2,3]，這種性狀基因型-表現型的關系可以被映射，以識別控制表型特征的基因組區(qū)域（即數量基因座位，QTL）[4]。目前，獲得這些數量性狀基因座位主要有兩種途徑：一是QTL定位分析；二是與性狀相關聯的分子標記的鑒定。QTL定位研究通過構建遺傳連鎖圖譜來鑒定性狀相關的特定染色體區(qū)段，即包含一個或若干個與性狀相關的基因的DNA區(qū)域。性狀相關分子標記鑒定根據表型和基因型的關系，通過一系列算法檢測單個標記與QTL是否連鎖來判斷標記附近是否存在QTL，估計其重組率及遺傳效應。如果標記與QTL存在連鎖，則其位點或附近存在QTL[5]。鑒定與經濟性狀相關的QTL和相關標記，進行遺傳改良，建立分子標記輔助育種技術，可以加快育種進程，提高育種效率。研究水產養(yǎng)殖動物經濟性狀相關的數量基因座位是水產分子育種領域研究的熱點。

鯉Cyprinus carpio是淡水養(yǎng)殖中最常見的優(yōu)良魚類之一，在我國年產量349萬t（FAO，2016），占世界鯉總產量的80%左右。我國是世界最大的鯉養(yǎng)殖國和消費國，對鯉生理、發(fā)育、免疫、遺傳育種等開展了廣泛而深入的研究。近二十年，不同基因組資源和遺傳工具的開發(fā)加快了遺傳改良和育種進程，包括數以萬計微衛(wèi)星標記和SNP標記的發(fā)掘[6,7]，不同版本的遺傳連鎖圖譜的構建[8-10]，轉錄組測序[11]，基于SNP分型的芯片[12]，全基因組物理圖譜的繪制[13]等。這些資源和工具的開發(fā)和利用使鯉數量性狀QTL定位已經取得了很大的進展。自構建了鯉的首張遺傳連鎖圖譜和鑒定出抗寒相關QTL以來[8]，相繼利用多個鯉群體和家系構建了多個連鎖圖譜，開展了相關性狀的QTL定位研究，如體質量[14-19]、體長[19-21]、食物轉化率[22-25]、肌肉脂肪含量[26]和肌纖維性狀[27]等性狀，獲得了多個家系的多個QTL定位結果。部分QTL定位結果已應用于鯉的育種實踐，指導和建立了鏡鯉的新品系，但對鯉生長速率性狀QTL定位研究卻很少[28]。

本研究利用553個分子標記構建了以良種祖父母后代培育出的鏡鯉雜交F2群體的遺傳連鎖圖譜，定位和分析了生長速率性狀的QTL。同時采用相關標記掃描全基因組，采用標記回歸方法確定與生長速率性狀連鎖的標記，在鯉全基因組中檢索，找到了與生長相關的候選基因，為深入研究鯉生長性狀相關的QTL和分子輔助育種（MAS）奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗用鏡鯉采自黑龍江水產研究所松浦試驗站，用雜交F2群體構建實驗群體。F0（祖父母本）為早期由國家原種和良種審定委員會鑒定為良種的德國鏡鯉選育系的后代，經微衛(wèi)星分子標記檢測遺傳差異，構建F1（父母本）家系，F1代經兩個冬季強化培育達2齡性成熟，雜交產生F2群體，池塘養(yǎng)殖2個月后，隨機選取75尾F2個體，單個個體在水族箱中連續(xù)飼養(yǎng)3個月后測量體質量。

1.2 方法

1.2.1 生長速率的測定和計算

測量75尾實驗魚的初始體質量后，每尾魚單獨飼養(yǎng)在一個水族箱（60cm×45cm×45cm）中，養(yǎng)殖條件和飽食投喂一致。連續(xù)飼養(yǎng)3個月后，測定體質量。剔除極端表現型個體，剩余68個個體進行后續(xù)數據分析，實驗魚初始體質量為（5.05±1.32）g，結束時終體質量為（238.31±47.24）g。用如下公式計算：生長速率（GR）=（Wt-W0）/t，式中，W0和 Wt分別為初始和終末體質量（g），t為飼養(yǎng)天數（d）。

實驗結束時，將實驗魚麻醉，尾靜脈抽血1mL。采用QIAampDNA Blood Mini Kit血液提取試劑盒，參照標準流程提取血液樣本的DNA。

1.2.2 基因型分析

采用PCR擴增法對所用微衛(wèi)星標記進行多態(tài)性篩選，用篩選出的多態(tài)性標記檢測群體的基因型。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系為15μL，其中包括：1U Taq DNA聚合酶（Sangon）、1×PCRbuffer（10mmol/LTris-HCl，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，0.01%gelatin，pH 8.3）、dNTPs各200 mmol/L、上下游引物各0.1mmol/L、100ng的模板DNA。PCR反應程序為：94℃預變性3min；94℃變性 30s，退火溫度 48～65℃ 30s，72℃延伸30s，共25個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增產物經135 V恒壓、8%聚丙烯酰胺凝膠電泳結合銀染法顯色后檢測個體基因型。利用Illumina的SNP芯片平臺進行SNP標記的基因分型。

1.2.3 遺傳連鎖圖譜的構建和QTL分析以及單標記回歸分析

選用在F2代個體中具有多態(tài)性且符合孟德爾分離比（P=0.05）的分子標記，利用 JoinMap 4.0[29]軟件構建遺傳連鎖圖譜。用MapQTL5.0[30]軟件的區(qū)間作圖法（Interval mapping）檢測生長速率性狀的QTL，通過置換實驗（1000次重復）確定連鎖群顯著性水平閾值，取LOD2.8為QTL存在的閾值。應用MapQTL5.0軟件進行標記回歸分析，采用最大似然比法，以P＜0.01為顯著性閾值檢測單一分子標記與生長速率性狀的連鎖關系。

圖1 鏡鯉群體生長速率性狀的正態(tài)分布Fig.1 The normal distribution of growth rate in the populations of mirror common carp

2 結果與分析

2.1 生長速率的測定及分析

根據我國《養(yǎng)殖魚類種質檢驗》第三部分性狀測定方法，測定和計算了實驗群體的生長速率性狀，測量值介于1.538～4.069 g/d，平均（2.592±0.506）g/d。運用SPSS11.5軟件計算生長速率值的峰度（Kurtosis）為 1.665，偏度（Skewness）為 0.065（表1）。經正態(tài)分布檢驗，以P=0.05為顯著性閾值，本實驗的P為0.074，符合正態(tài)分布（圖1），未發(fā)生偏分離，可以進行下一步的QTL定位研究（表1）。

2.2 遺傳連鎖圖譜的構建

用600余對微衛(wèi)星引物對基因組DNA進行PCR擴增和電泳檢測，各微衛(wèi)星均獲得了穩(wěn)定、清晰的DNA條帶，個體間呈不同程度的多態(tài)性。圖2為微衛(wèi)星HLJ365對68個試驗個體的擴增結果，其中217個微衛(wèi)星標記的多態(tài)性在10%以上。SNPs標記基因分型數據由基因芯片平臺自帶軟件自動讀取和分析，手工剔除錯誤分型標記后，剩余336個多態(tài)性SNPs標記。這兩種標記共553個用于本研究中，用JoinMap4.0軟件對這553個分子標記進行連鎖分析，其中507個標記（微衛(wèi)星標記186個，SNPs標記321個）共組成了50個連鎖群，覆蓋基因組總長度為2805.85cM，每個連鎖群有10.1個標記，標記間平均距離為6.31cM。

表1 鏡鯉生長速率正態(tài)分布檢驗Tab.1 Test of Gaussian distribution for growth rate in mirror common carp

圖2 微衛(wèi)星標記HLJ365在68個鯉樣本的擴增結果Fig.2 Amplification of HLJ365 in 68 samples of mirror common carp

2.3 生長速率性狀的QTL定位

采用MapQTL5.0軟件的區(qū)間定位作圖，通過置換檢測（Permutation test）確定LOD=2.8為QTL存在與否的閾值。在各連鎖群上對鯉生長速率性狀進行區(qū)間作圖定位分析中，共檢測到10個與該性狀相關的QTL區(qū)間，分別定位到鯉連鎖圖譜的LG1、LG5、LG12、LG35、LG36 和 LG47 等 6 個連鎖群上，LOD介于2.80～5.64之間，解釋表型變異介于19.2～55.2%之間（表2，圖3）。其中，qGR35-1的LOD（5.64）最大和最高，可解釋表型變異值（55.2%）。第35連鎖群群（LG35）的 QTL最多，4個 QTL，解釋表型變異分別為55.2%、19.2%、43.4%和43.9%；第1連鎖群（LG1）次之，2個QTL，解釋表型變異分別為54.5%和25.0%；其他連鎖群上各有一個QTL。本研究中的10個生長速率性狀QTL中，9個QTL的單個QTL解釋表型變異率大于20%，為生長速率性狀的主效QTL區(qū)間。

2.4 生長速率性狀的單標記回歸分析結果

利用MapQTL5.0軟件中的Kruskal-Wallis檢驗對507個微衛(wèi)星和SNP標記與生長速率性狀進行標記回歸分析，對鯉進行全基因組掃描。結果檢測到16個標記與生長速率性狀極顯著相關（P＜0.01），解釋表型變異范圍為10.7%～34.7%，其中7個標記（HLJ365、SNP0137、SNP1167、SNP0167、SNP0919、SNP1041和HLJ401）解釋表型變異達到20%以上（表3）。將這16個標記位點在鯉全基因組中進行檢索，獲得13個候選基因（其中SNP0137、SNP1096和SNP1167三個標記位于同一基因上，SNP0674和SNP0675位于同一基因上）。對所有基因的注釋結果分別為：肌球蛋白家族（myosin-Va和myosin-VIIa）、生長激素調節(jié)的 TBC蛋白（growth hormone-regulated TBC protein）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase-like）、維生素K依賴性蛋白（vitamin K-dependent protein C-like）、胰腺α-淀粉酶（pancreatic alpha-amylase-like）、載脂蛋白（apolipo Eb-like）、核糖體蛋白（60S ribosomal protein L18）、視覺受體樣蛋白（visual pigment-like receptor peropsin）、突觸素抗體蛋白（synapsin-2-like）、胸腺細胞選擇相關的高遷移率族盒蛋白（thymocyte selection-associated high mobilitygroup boxprotein）及兩個未知蛋白（LOC109104831和LOC109098948）等。鑒定出這些候選功能基因為鯉生長相關的分子機理研究提供了信息。

圖2 鏡鯉生長速率性狀QTL定位的LOD曲線Fig.3 Location of the QTL for growth rate in linkage group of the mirror common carp

表2 鏡鯉生長速率性狀的QTL 分析結果及遺傳效應估計Tab.2 QTL detection for growth rate and estimation of genetic effects in mirror common carp

表3 鏡鯉生長速率性狀相關標記及候選基因Tab.3 Markers associated with growth rate and corresponding candidate genes in mirror common carp

3 討論

鯉生長速率為多基因數量控制的經濟性狀，常與個體發(fā)育速度和年齡以及其他生活史性狀相關[31,32]。本研究采用的鯉家系處于生長早期階段，僅在2～5個月的年齡段內檢測和估計了QTL效應，它們對生長后期和收獲產量的有效性可能存在疑問。但以前的研究結果表明，鯉早期和后期的生長存在高度的遺傳相關性[32,33]。這與Unwin等[34]對鮭的研究結果類似，即幼魚早期生長速度也會影響最終的收獲質量。這些研究結果暗示，生長相關的基因座在整個生長周期中持續(xù)影響生長。本研究獲得的生長速率相關的基因座，如果在早期實施選擇，對后期生長速率乃至收獲產量同樣有很大效果；加速早期選擇對該性狀的遺傳改良作用，能縮短生長周期。

連鎖分析和單標記回歸分析是解析復雜數量性狀的遺傳基礎的主要方法[5]。本研究采用這兩種方法，共獲得鯉生長速率相關的數量基因座位26個，分布在鯉基因組多個染色體上，符合多基因數量性狀的特征。在獲得的10個鯉生長速率相關的QTL中，有9個單個QTL對性狀的貢獻率大于20%，是生長速率性狀的主效QTL區(qū)間，暗示對該性狀具有重要作用。與Laghari等[28]的研究結果相比，本研究所有的QTL區(qū)間全為新發(fā)現的QTL。Laghari等2013年在荷包紅鯉和大頭鯉雜交F2群體的QTL定位研究中，共獲得7個生長速率性狀相關QTL，解釋表型變異32.1%～34.4%之間。獲得的16個極顯著相關的分子標記，解釋表型變異均在10%以上，其中單個標記貢獻率大于20%的標記有7個，其中最大解釋表型變異高達34.7%，說明這些標記對生長速率性狀具有重要的作用，可作為分子標記輔助育種（MAS）的應用對象?？v觀QTL定位分析和單標記回歸分析結果，發(fā)現部分分析結果高度重合。其中單標記回歸分析中位于第一連鎖群（LG1）上的兩個標記（HLJ365和SNP0137）分別位于qGR1-1和qGR1-2兩個QTL區(qū)間內；位于第35連鎖群（LG35）上的兩個顯著相關的標記SNP0919和SNP1041分別位于qGR35-2和qGR35-3上；位于LG47上的HLJ401也是位于qGR47-1區(qū)間上。這些檢測結果的相互驗證，證實本試驗結果的可靠性。

為了獲得控制生長速率性狀相關的候選基因，本研究比對分析了與生長速率性狀顯著相關的16個標記所在的核酸序列在鯉全基因組物理圖譜，確定了一批鯉生長速率相關的候選基因。由結果可知，16個標記對應13個編碼基因。其中，肌球蛋白是肌肉細胞的重要組分，影響肌肉的生長速度和肌纖維的組成[35,36]。酶胰腺α-淀粉酶是一種重要的水解酶，參與碳水化合物的消化和吸收[37]。核糖體蛋白基不僅負責細胞內蛋白質的合成，還與細胞的生長、分化、胚胎發(fā)育等有關[38,39]。這些基因參與魚體生長的具體生理生化即代謝過程還需進一步研究驗證。

對生長率性狀QTL的鑒定有助于更好地在遺傳和細胞水平上了解生長；標記輔助育種可提高生長速度以獲得更高的產量。本研究獲得的對性狀貢獻較大的分子標記可直接應用于標記輔助選擇育種，提高鯉生長速率，加快育種進程。但本研究樣本量和標記數仍然相對有限，需要對更大樣本的群體和更多標記作進一步的鑒定和驗證分析。