響應(yīng)面法優(yōu)化民族藥地板藤總黃酮提取工藝及其體外抗EV71病毒研究

張 洪 朱 雪 王 帥 李 菁 馬大龍 張曉平

?？崎艑僦参锏毓?Ficus tikoua Bur.)為多年生匍匐木質(zhì)落葉藤本，又名地石榴、地瓜藤、地枇杷等，全株有白色的乳汁，主要分布于我國(guó)云南、貴州、廣西、湖北、甘肅等地。藤莖入藥為地板藤，始載于《滇南本草》，其味苦，性寒，有清熱利濕、活血通絡(luò)、解毒消腫之療效，主治小兒消化不良、急性胃腸炎、痢疾、黃疸、風(fēng)濕痹痛、帶下、跌打損傷，是彝、苗、壯、傣、哈尼等民族廣泛使用的民族藥，資源豐富，藥用價(jià)值高[1,2]。本品《中國(guó)藥典》2015版未收載，《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(第1冊(cè)2005版)》有收載。地板藤主要含有黃酮類、三萜類、甾體類、香豆素類、有機(jī)酸類等化合物[3～9]。

本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，以乙醇為提取溶劑，以提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比為考察因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，采用Box-Benhnken響應(yīng)面法優(yōu)化地板藤總黃酮的提取工藝并探究最優(yōu)提取條件下地板藤總黃酮的抗病毒作用，為地板藤藥材的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)[10～16]。

材料與方法

1.材料：地板藤藥材(云南省昆明市新螺螄灣中藥材國(guó)際商貿(mào)城，批號(hào)：20160523)經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院藥用植物學(xué)楊耀文教授鑒定為?？浦参锏毓鸉icus tikoua Bur.的干燥藤莖(粉碎，過(guò)40目篩，備用)；腸道病毒71型(EV71)；橫紋肌瘤細(xì)胞(RD)； NaNO2(上海滬試化工有限公司,批號(hào)20150708)；Al(NO3)3(天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號(hào)20160103)；NaOH(上海滬試化工有限公司,批號(hào)20171110)；培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)8118120)；PBS磷酸鹽緩沖液(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)8116531)；MTT(美國(guó)VWR LifeScience公司，批號(hào)1636C097)；0.25%Trypsin-EDTA(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)1869505)。

2.儀器：酶標(biāo)儀(Epoch 2微孔板分光光度計(jì)，美國(guó)Bio Tek公司)；離心機(jī)(TDD5M臺(tái)式多管自動(dòng)平衡離心機(jī))；水浴加熱鍋(DZKW-S-6型，北京永光明醫(yī)療儀器廠)；4℃冰箱(BCD-278TAJ型，海爾公司產(chǎn)品)；-80℃冰箱(DW-86L286型，海爾公司產(chǎn)品)。

3.醇提法提取地板藤總黃酮：精確稱藥材粉末5g，乙醇回流提取后，濃縮，乙醇溶液定容于100ml容量瓶中，搖勻待用。

4.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取蘆丁對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6ml，分別置于25ml量瓶中，各加30%乙醇至6.0ml，加5%NaNO2溶液1ml，混勻，靜置6min，加10%Al(NO3)3溶液1ml，搖勻，靜置6min，加NaOH試液10ml，再加30%乙醇至刻度，搖勻，靜置15min，以相應(yīng)試劑為空白，在500nm紫外波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

6.Box-Benhnken響應(yīng)面法優(yōu)化地板藤總黃酮提取工藝：使用依據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，選取影響地板藤總黃酮得率較大的3個(gè)因素(料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度)為自變量，以總黃酮得率(%)為響應(yīng)值，采用 Design-Expert V11.1.0.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，進(jìn)一步進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。

7.病毒的準(zhǔn)備：取200μl EV71病毒毒株接種至長(zhǎng)成的單層RD細(xì)胞上，吸附30min后，加入10ml 2% DMEM維持液后，在37℃、5%CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照，當(dāng)90%以上的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，反復(fù)凍融3次，并吹打離心(1000r/min，20min)，定量分裝上清液，待用。

9.Reed-Meuench公式法計(jì)算藥物毒性：將試驗(yàn)藥物用2%DMEM維持也稀釋10個(gè)濃度梯度，接種于已經(jīng)長(zhǎng)成單層的RD細(xì)胞的96孔板中，設(shè)4個(gè)復(fù)孔、細(xì)胞對(duì)照孔和空白對(duì)照孔，置37℃、5% CO2病毒培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，倒置顯微鏡逐日觀察，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)90%以上病變時(shí)終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去孔內(nèi)上清液。每孔加入150μl二甲基亞砜，待沉淀結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度A值，計(jì)算TC50。TC50=[Antilog (log高于50%CPE百分率病毒稀釋度+比距)]×C。

10.MTT法進(jìn)行地板藤總黃酮抗病毒試驗(yàn)：在已長(zhǎng)成單層的RD細(xì)胞中自無(wú)毒濃度起每孔加入100ml供試品，供試品用2% DMEM培養(yǎng)液二倍比系列稀釋并設(shè)置10個(gè)濃度梯度，每孔再加入100μl 100倍TCID50的病毒液，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組及空白細(xì)胞對(duì)照組，每組4個(gè)復(fù)孔，置37℃、5% CO2病毒培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，48h后終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去孔內(nèi)上清液。每孔加入150μl二甲基亞砜，待沉淀結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度A值，計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(EC50)和治療指數(shù)(TI)。EC50=[Antilog(高于50%CPE百分率病毒稀釋度的值-比距)]×C;治療指數(shù)(TI)=半數(shù)毒性濃度(TC50)/半數(shù)有效濃度(EC50)。

結(jié) 果

1.單因素考察試驗(yàn)結(jié)果：在單因素試驗(yàn)中，對(duì)于提取時(shí)間的單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，當(dāng)提取時(shí)間為0.5h時(shí)，地板藤中總黃酮得率為0.3405mg/ml，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到1.0h時(shí)總黃酮得率達(dá)到最大，為0.3507mg/ml，0.5～1.0h，地板藤中總黃酮得率隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)而逐漸增大；當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到1.5h，總黃酮得率最低，為0.2518mg/ml，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)增加至0.2950mg/ml，但得率整體下降。因此，選擇0.5、1.0、1.5h 3個(gè)提取時(shí)間水平進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)于乙醇濃度的單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，當(dāng)乙醇濃度為40%～60%，隨著乙醇濃度的增加地板藤中總黃酮得率自0.2452mg/ml逐漸增大；當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)總黃酮得率最大，為0.3333mg/ml；乙醇濃度大于60%后，總黃酮得率隨乙醇濃度增大而逐步下降至0.2933mg/ml。因此，選擇50%、60%、70% 3個(gè)乙醇濃度水平進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 提取時(shí)間對(duì)得率的影響

圖2 乙醇濃度對(duì)得率的影響

對(duì)于料液比的單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，隨料液比的增加地板藤中總黃酮得率由0.1994mg/ml逐漸增加至0.3517mg/ml。綜合考慮到節(jié)約人力、資源等因素，選擇1∶20、1∶30、1∶40g/ml 3個(gè)料液比水平進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)于提取溫度的單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，提取溫度為50℃時(shí)，地板藤中總黃酮得率最高，為0.3245mg/ml。綜合4個(gè)單因素試驗(yàn)，提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響較小，因此不對(duì)提取溫度因素進(jìn)行優(yōu)化，僅選擇50℃作為提取溫度的條件使用。

圖3 料液比對(duì)得率的影響

圖4 提取溫度對(duì)得率的影響

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 方差分析

圖5 各因素交互作用對(duì)地板藤中總黃酮得率的影響

3.驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)優(yōu)選得到的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，分別稱取樣品粉末10g，各5份，測(cè)定其總黃酮得率所得率為1.1687%(RSD=0.93%，n=5)，說(shuō)明該回歸方程對(duì)總黃酮得率的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率高，所優(yōu)化的總黃酮工藝重復(fù)性及可操作性均較好。

4.體外抗病毒試驗(yàn)結(jié)果：在病毒的毒力測(cè)定試驗(yàn)中，測(cè)得TCID50值為10-4.42；在藥物的毒性測(cè)定試驗(yàn)中，測(cè)得TC50值為0.789；在總黃酮的藥物毒性試驗(yàn)中測(cè)得EC50值為0.084，計(jì)算得治療指數(shù)TI值為9.39。表明地板藤總黃酮在體外表現(xiàn)出了較好的抗EV71病毒作用。

討 論

響應(yīng)面優(yōu)化法(RSM)是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，有著試驗(yàn)精度高、次數(shù)少、數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性好等優(yōu)勢(shì)，且對(duì)試驗(yàn)每個(gè)水平均可進(jìn)行連續(xù)分析，克服了正交試驗(yàn)只能對(duì)某一獨(dú)立點(diǎn)進(jìn)行分析的缺點(diǎn)。響應(yīng)面優(yōu)化法主要有Doehlert(DM)、星點(diǎn)設(shè)計(jì)(CCD)與Box-Behnken(BBD)3種常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。

本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法，對(duì)地板藤總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。首先通過(guò)單因素考察，發(fā)現(xiàn)提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比4個(gè)因素對(duì)醇提總黃酮得率均有不同程度的影響，后以對(duì)總黃酮得率作用較顯著的3個(gè)因素作為優(yōu)化條件，采用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定地板藤中總黃酮的最佳提取工藝條件為料液比1∶40，提取時(shí)間1.5h，乙醇濃度55.4249%，此時(shí)總黃酮得率最高，達(dá)到1.169%，該提取方法經(jīng)濟(jì)可行，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)用于工業(yè)化生產(chǎn)。地板藤總黃酮表現(xiàn)出較好的抗EV71病毒效果，后續(xù)加強(qiáng)研究地板藤中總黃酮對(duì)其他病毒的抑制作用并進(jìn)一步分離純化，以期找到其發(fā)揮作用的主要有效成分，為地板藤資源的開(kāi)發(fā)利用奠定良好的基礎(chǔ)。

(致謝：本研究在山東中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新訓(xùn)練平臺(tái)上完成，項(xiàng)目號(hào)2018057，特此感謝)