嬰幼兒配方奶粉中甘油三酯Sn-2位脂肪酸的檢測

文/王俊芳 楊國良 王榮艷

（1 杭州千島湖天鑫有限公司濱江分公司；2 杭州璞湃科技有限公司；3 杭州立高檢驗檢測技術研究院有限公司）

脂肪是嬰幼兒配方奶粉的重要組成部分，不僅提供嬰幼兒生長發(fā)育所需能量50%～60%，還促進多種維生素和礦物質的吸收，其中甘油三酯占總脂肪的比重最高。

根據(jù)研究表明，脂肪酸在甘油三酯上的空間分布對脂肪和鈣的吸收具有較大的影響[1]。Jensen等[2]研究表明嬰兒對Sn-2位棕櫚酸含量較大的奶粉中肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸的吸收率較高。Lopez等[3]研究還發(fā)現(xiàn)嬰兒食用高含量Sn-2位棕櫚酸嬰兒配方奶粉較食用普通嬰兒配方奶粉的糞便中的棕櫚酸含量低，更證明了其對肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸的吸收有增強效果。Carnielli等[4～5]采用Sn-2位棕櫚酸含量不同的配方奶粉喂養(yǎng)嬰兒，結果表現(xiàn)為用Sn-2位棕櫚酸含量高的配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒，其糞便中鈣的含量明顯降低，也證明了Sn-2位棕櫚酸對鈣的吸收有促進作用。Nelson等[6]也采用了類似的實驗，證實了高含量Sn-2位棕櫚酸的配方奶粉有助于嬰兒對鈣的吸收。而研究表明人乳中棕櫚酸作為主要飽和脂肪酸，在Sn-2位上的占比高達70%[7，8]；而牛乳中棕櫚酸在Sn-2位上的比例約為32%[9]。所以，提高嬰幼兒配方奶粉中Sn-2位棕櫚酸的含量，使其更接近人乳，也是嬰幼兒配方奶粉發(fā)展的方向。

國內外對脂肪酸在甘油三酯上分布的研究已經(jīng)很多，基本原理都是采用專一的胰脂肪酶或化學試劑選擇性的水解甘油三酯，得到Sn-2位上的脂肪酸，再通過不同技術分離提取，衍生脂肪酸甲酯后用氣相色譜定量分析。Brockerhoff[10]采用格氏試劑將甘油三酯水解形成Sn-1，2和Sn-2，3甘油二酯，再用磷脂酶A2進行水解，得到Sn-2位上的脂肪酸，再采用薄層色譜（TLC）分離得到Sn-2位上酶解得到的脂肪酸，衍生后，用氣相色譜（GC）對脂肪酸組成進行測定。此方法經(jīng)過研究人員多次改進，但操作步驟還是繁瑣，耗時耗力；韓瑞麗等[11]用豬胰脂酶水解，得到Sn-2位單甘酯，再采用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測法分離出Sn-2位單甘酯，衍生后，用GC測定；賈云虹等[12]同樣使用豬胰脂酶水解，用反相高效液相色譜法作為分離Sn-2位單甘酯的方法，再用GC測定；這兩者都采用儀器作為分離方法，分析成本大、時間長，不適合大批量樣品。

本研究采用氨基固相萃取柱（NH2-SPE）分離單甘酯，既解決了TLC操作繁瑣，耗時耗力的缺點，檢測成本也不高，適用于日常檢測分析，處理方法簡單、準確、快速。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

正己烷、丙酮為色譜純，其他試劑均為分析純；豬胰脂酶、三羥甲基氨基甲烷、37 種脂肪酸甲酯標準品均購于Sigma公司；氨基固相萃取柱（6cc）購于Waters公司和Agela公司。

7890A氣相色譜儀購于Agilent公司；離心機購于B e c k m a n Coulter 公司。

1.2 樣品預處理

1.2.1 脂肪提取

采用堿性乙醚石油醚方法提取奶粉中的脂肪。此方法是公認的提取脂肪方法，提取效率高，操作簡單。

1.2.2 Sn-2位脂肪酸的測定

稱取已提取的油脂20 mg于10 mL試管中，加入1 mol/L三羥基甲基氨基甲烷/鹽酸緩沖水溶液（pH 值8.0）2 mL，2.2%氯化鈣水溶液0.2 mL，1 g/L膽酸鈉水溶液0.5 mL，混合均勻，40 ℃下水浴1 min，再加入胰脂肪酶20 mg，混勻后繼續(xù)水浴3 min，在自來水下冷卻，添加6 mol/L鹽酸溶液1 mL和乙醚2 mL，混勻，4 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液45 ℃下氮氣吹干，加入1 mL正己烷溶解，備用。依次用5 mL丙酮和正己烷活化氨基柱（Waters 500 mg/6 mL），將上述1 mL酶解產(chǎn)物上樣，用15%丙酮/正己烷（v/v）5 mL淋洗，50%丙酮/正己烷（v/v）5 mL洗脫，收集洗脫液，45 ℃下氮氣吹干。在上述分離產(chǎn)物中加入1 mol/L氫氧化鉀/甲醇溶液0.7 mL，混勻，置于60 ℃水浴中振蕩3 min，待冷卻至室溫，加入14%三氟化硼/甲醇（v/v）溶液1 mL，混勻，置于60℃水浴中反應30 min，待冷卻至室溫，加入飽和氯化鈉溶液2 mL和正己烷1 mL，混勻，4 000 r/min離心5 min，取上清液，氣相色譜檢測。

1.2.3 總脂肪酸的測定

稱取已提取的油脂20 mg于10 mL試管中，加入1 mol/L氫氧化鉀/甲醇溶液0.7 mL，混勻，置于60 ℃水浴中振蕩3 min，待冷卻至室溫，加入14%的三氟化硼/甲醇（v/v）溶液1 mL，混勻，置于60 ℃水浴中反應30 min，待冷卻至室溫，加入飽和氯化鈉溶液2 mL和正己烷1mL，混勻，4 000 r/min離心5 min，取上清液，氣相色譜檢測。

1.2.4 氣相色譜儀檢測條件

色譜柱：supeclo 2560（100 m×250 μm×0.20 μm）；進樣口溫度：240 ℃；分流比10:1；進樣量1 μL。程序升溫：初始溫度60 ℃（保持2 min），以15 ℃/min升至100 ℃，再以3 ℃/min升至230 ℃（保持18 min）。載氣（N2）：1.0 mL/min；檢測器溫度：250 ℃；H2流速：40 mL/min；空氣流速：400 mL/min。

表1 NH2-SPE分離步驟

2 結果與討論

2.1 Sn-2位脂肪酸的分離

本方法采用Wares公司NH2-SPE作為分離手段，調整洗脫溶劑的極性，將Sn-2甘單脂分離收集。以硬脂酸、棕櫚酸單甘酯、硬脂酸甘油二酯、硬脂酸甘油三酯作為代表，用NH2-SPE柱不同比例的洗脫溶劑分離，氮氣吹干，衍生后，測定是否含有棕櫚酸來確定只有甘油單酯洗脫下來的溶劑比例，結果見表1。根據(jù)棕櫚酸的檢測結果，最終確定丙酮:正己烷（15:85，v/v）作為淋洗溶劑，丙酮:正己烷（50:50，v/v）作為洗脫溶劑。本實驗還考察了不同公司NH2-SPE對實驗的影響，發(fā)現(xiàn)Agela公司和Waters公司最佳洗脫梯度有差別，見表1。

2.2 方法回收率和精密度實驗

稱取20 mg嬰幼兒配方奶粉中提取的脂肪，定量加入1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（OPO）標準品2 mg，設5 個平行，按本方法處理后進行氣相色譜檢測，計算回收率和相對標準偏差（RSD）值。結果見表2，可知回收率在81.85%～88.9%，RSD在5%以下，重現(xiàn)性較好，結果較為穩(wěn)定。

2.3 薄層色譜法和 NH2-SPE的數(shù)據(jù)對比

對同一嬰幼兒配方奶粉，分別采用國標GBT 24894—2010方法和本方法檢測分析比較Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸含量，結果見表3。數(shù)據(jù)顯示兩種方法的結果較為接近，但相對國標采用的TLC分離方法，NH2-SPE作為分離方法，具有操作步驟簡單，用時少的優(yōu)點。

2.4 樣品結果

現(xiàn)售嬰幼兒配方奶粉中有部分產(chǎn)品通過添加精煉植物油或OPO來提高棕櫚酸在甘油三酯2 位上所占的比例，從而促進牛乳中鈣、鎂、脂肪等營養(yǎng)物質的吸收。

采用本方法對市售的奶粉進行檢測分析，結果見表4。結果表明：樣品1～3配方奶粉中未添加結構油脂，劉彪等[14]測定的普通配方奶粉Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的含量為25%～30%，樣品1～3配方奶粉中Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的含量為22%～28%；樣品4～6在配方奶粉中添加精煉植物油，Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的含量提高至33%～37%；樣品7～11在配方奶粉中添加OPO，Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸百分比含量提高至41%～46%。配方奶粉中添加精煉植物油和OPO都可以有效提高Sn-2位棕櫚酸是含量，添加OPO的效果更明顯。

3 小結

本研究建立了豬胰脂酶水解，NH2-SPE分離Sn-2位單甘酯，氣相色譜法檢測定量嬰幼兒配方奶粉中Sn-2位脂肪酸的方法。本方法前處理方便，用時少，可大批量樣品同時處理，能準確測定嬰幼兒配方奶粉中Sn-2位脂肪酸，結果穩(wěn)定、可靠，滿足日常檢測要求。

表2 OPO回收率和精密度

表3 TLC法和SPE法數(shù)據(jù)對比

表4 Sn-2位脂肪酸占對應脂肪酸含量的比例