豬丹毒絲菌的分離鑒定與藥敏分析

祭冬琴，王 旭

（鹽城光明生豬有限公司，江蘇 鹽城 224151）

豬丹毒是由豬丹毒絲菌（E.rhusiopathiae）引起的一種人畜共患傳染病，豬感染后死亡率較高，對生豬養(yǎng)殖造成重大損失。該病流行于世界各地[1]，在夏季高發(fā)，發(fā)病豬背、頸、耳后等部位出現(xiàn)紫紅色斑塊；病豬呼吸急促，體溫升高；有時會出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、癱瘓、無法站立等臨床癥狀。解剖死豬，可見腹股溝淋巴結(jié)腫大出血，十二指腸及空腸前段出血，大腸漿膜有灰白色壞死灶，肺充血，胸腔內(nèi)有淡黃色積水[2]。

由于生物學(xué)鑒定耗時長，步驟繁瑣，不太適合養(yǎng)殖生產(chǎn)中使用，因此，借鑒相關(guān)研究，將分子生物學(xué)方法引進(jìn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中使用，可以快速診斷病原，及早治療。對豬丹毒絲菌進(jìn)行藥敏分析，篩選最佳治療藥物，為當(dāng)?shù)厣i養(yǎng)殖過程中豬丹毒的防控提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發(fā)病豬于2018年6月取自鹽城市大豐區(qū)某標(biāo)準(zhǔn)化生豬養(yǎng)殖場，體重30 kg左右，剛開始豬食欲不振，沒有精神，體溫40.2℃，耳根處出現(xiàn)少許紫色斑塊，初步診斷為豬丹毒。試驗用藥敏紙片采購自杭州微生物試劑有限公司；PCRMix、溴化乙錠（EB）、Marker 2 000采購自北京艾德萊生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒采購自北京天根生化科技有限公司；用于擴(kuò)增豬丹毒絲菌的引物由上海生工合成；血瓊脂平板采購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 病原菌的分離

在超凈工作臺中，將病死豬的肝臟表面用酒精棉消毒，用滅菌后的接種環(huán)刮取后接種于血平板，37℃培養(yǎng)24 h。挑選優(yōu)勢菌落接種于斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌的鑒定

按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取分離到的致病菌DNA，使用豬丹毒絲菌16S rDNA引物[3]擴(kuò)增致病菌DNA，以豬丹毒絲菌DNA為陽性對照，以ddH2O為陰性對照。正向引物F：TGACATACCGCG CAAAAGCA、逆向引物R：GGCTCCCTCCTAGTAAAC TA，目的片段長度為472 bp，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增后，用添加EB的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳電壓120 V、電泳15 min。電泳后使用紫外分析儀觀察結(jié)果。

1.4 豬丹毒絲菌藥敏分析

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法），在超凈工作臺中，將分離到的致病菌用生理鹽水制備成濃度約107～108cfu/mL細(xì)菌懸濁液，然后取100 μL涂布于血平板，等待15 min，將不同的藥敏紙片均勻地貼在血平板上，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果，量取抑菌圈直徑，確定致病菌對各藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病情況

發(fā)病豬場位于江蘇大豐，為標(biāo)準(zhǔn)化生豬養(yǎng)殖場，有完善的排水通風(fēng)設(shè)備，存欄生豬2 600頭。2018年6月初發(fā)現(xiàn)個別豬精神萎靡，無食欲，體溫達(dá)40.2℃，2 d后發(fā)現(xiàn)耳后出現(xiàn)紅色色斑，3 d后死亡，隨著時間推移，病情有擴(kuò)散跡象。

2.2 致病菌的分離鑒定

從患病豬的肝上分離到致病菌，其在血平板上培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)半透明、邊緣整齊、針尖大小的圓形菌落，菌落周圍有輕微溶血。致病菌的PCR電泳圖譜見圖1，由圖1可以看出，致病菌使用豬丹毒絲菌特異性引物作PCR，在450 bp位置出現(xiàn)亮帶，與陽性對照位置相同，陰性對照未出現(xiàn)條帶，說明分離的致病菌是豬丹毒絲菌。

圖1 致病菌的PCR電泳圖譜

2.3 致病菌的藥敏分析

使用畜牧養(yǎng)殖中常用的恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林等抗生素對分離的致病菌進(jìn)行藥敏試驗，藥敏試驗結(jié)果見表1。結(jié)果表明，分離的豬丹毒絲菌對恩諾沙星、氟苯尼考和慶大霉素等敏感，對萬古霉素、卡那霉素等耐藥。

表1 各抗生素藥敏結(jié)果

3 討論

豬丹毒絲菌在自然界廣泛分布，可寄生于哺乳動物、鳥類、兩棲類等，其中豬對該菌最為敏感[4]。豬丹毒絲菌引起的豬丹毒是一種急性的人畜共患病，可以引起豬急性的敗血癥和慢性的關(guān)節(jié)炎，以及心內(nèi)膜炎，對其他畜牧養(yǎng)殖品種也存在一定的危害。豬丹毒流行于世界各國家及地區(qū)，也是我國主要的豬傳染病之一，對生豬養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

豬丹毒絲菌隨發(fā)病豬的排泄物排出，污染豬棚、飲水，該菌也可以通過損傷皮膚及蚊蟲叮咬傳播。豬丹毒以急性型最常見，該病突然暴發(fā)，發(fā)病時間短，死亡率高，因此，提早發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)病原是防控豬丹毒的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的生物學(xué)鑒定耗時長，步驟繁瑣，且具有一定的主觀性，一般需要2～3 d才可完成，延誤了疾病的治療[5]。本文采用分子生物學(xué)方法檢測豬丹毒絲菌，從采樣到確認(rèn)病原僅需幾個小時，大幅提高了檢測效率，可以及時確認(rèn)病原，對癥下藥。

董建斐等（2018）對從浙江寧波某養(yǎng)殖場分離的豬丹毒絲菌進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該豬丹毒絲菌對阿莫西林、恩諾沙星等敏感，對慶大霉素、卡那霉素等耐藥[6]。這與本文結(jié)果有所差異，可能是因為各地區(qū)養(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖習(xí)慣和用藥習(xí)慣不同，造成不同地區(qū)豬丹毒絲菌對抗生素的敏感性不同。

按照本次藥敏試驗的結(jié)果，選擇恩諾沙星作為治療藥物。由于發(fā)病豬精神萎靡，食欲不佳，我們先將發(fā)病豬隔離，然后采用肌肉注射恩諾沙星，每天注射1次，同時監(jiān)測體溫，直到體溫下降、食欲恢復(fù)后停止注射；對未發(fā)病的豬拌服恩諾沙星，連續(xù)投喂，直到場中不再有新發(fā)病豬；加強(qiáng)豬場消毒，每天消毒兩次。采取以上措施進(jìn)行防控后，該豬場豬丹毒疫情得到有效控制，15 d后該豬場未發(fā)生死豬的情況。