2018年江西及福建省新現(xiàn)豬急性腹瀉冠狀病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查

張譽瀚，袁為鋒，張帆帆，李 凱，李指全，宋德平，唐玉新

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西省動物疫病診斷與防控重點實驗室，南昌 330045）

2017年2月，研究人員從廣東腹瀉哺乳仔豬中檢測到一種新的類似蝙蝠冠狀病毒HKU2的冠狀病毒：豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus,SADS-CoV），隨后該病毒被成功分離，動物試驗證實了該病毒可引起仔豬急性腹瀉，發(fā)病率和死亡率均非常高[1]；SADS-CoV是甲型冠狀病毒屬成員，具有典型的冠狀病毒結(jié)構(gòu)，病毒表面有突起，直徑為100～200 nm，基因組為單股正鏈RNA。全基因組序列分析顯示SADS-CoV全長27 155 nt，與來源于蝙蝠的冠狀病毒HKU2同源性高達(dá)95%，但兩者的纖突蛋白序列核苷酸和氨基酸相似性分別只有80%和87%，這表明HKU2不是SADS-CoV的直接祖先，但兩者在遺傳進(jìn)化上相近[1-2]。據(jù)報道，SADS-CoV主要引起仔豬的水樣腹瀉，劇烈嘔吐、消瘦和脫水，其中5日齡以下感染仔豬死亡率達(dá)90%，8日齡以上感染仔豬死亡率低于5%。自2016年10月SADS-CoV在廣東清遠(yuǎn)某豬場暴發(fā)后，相繼又在該地區(qū)的其它3個豬場暴發(fā)，截至2017年5月該病毒共造成24 693頭仔豬死亡，但該病毒目前僅在廣東清遠(yuǎn)地區(qū)報道過。研究發(fā)現(xiàn)SADS-CoV不與目前豬場流行的3種冠狀病毒：豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV）及豬德爾塔冠狀病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCoV）的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，因此現(xiàn)有的豬冠狀病毒疫苗對SADS-CoV感染可能無效，這對我國新生仔豬腹瀉病原的檢測與防控提出新的挑戰(zhàn)[1-5]。

目前，SADS-CoV的診斷方法主要有病原分離鑒定、免疫熒光染色、RT-PCR等方法。分離培養(yǎng)法對實驗室的條件要求較高，費時且操作繁瑣，對人員的技能要求較高[6]。PCR法不但能克服病毒分離困難，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)等特點，還具有敏感性高，特異性強(qiáng)的特點。普通PCR方法雖然操作簡便但由于其檢測的靈敏度有限，極易出現(xiàn)假陰性。套式PCR方法與普通PCR方法相比具有更高的靈敏度和特異性且經(jīng)濟(jì)、易于推廣等諸多優(yōu)點[7]。本研究旨在建立一種快速敏感的檢測方法，為SADS-CoV的臨床診斷和流行病學(xué)研究提供更為敏感和可靠的手段。

1 材料與方法

1.1 毒株及臨床樣品

SADS-CoV毒株為從臨床發(fā)病豬場樣品中分離獲得，由本實驗室保存。臨床樣品為2018年從江西及福建8個規(guī)模豬場采集的492份豬糞便樣品，-80℃保存。

1.2 試劑

酵母提取物、胰蛋白胨、氨芐青霉素均購自北京索萊寶科技有限公司；TaKaRa Ex Taq、10×Ex Taq Buffer、dNTP Mixture、DL 2 000 DNA Marker、pMD18-T載體均購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

SorvallST16R高速冷凍離心機(jī)和Legend Micro 21R高速冷凍離心機(jī)均購自美國Thermo公司；NanoDrop 2000微量核酸測定儀購自美國基因公司；Applied Biosystems 9700 PCR儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；水平電泳槽購自北京六一科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司。

1.4 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中公布的豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒GDS04毒株（GenBank登錄號MF167434）的N基因保守區(qū)域，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計兩對特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。其它相關(guān)病毒，如PEDV和PDCoV的檢測引物參考Song等的引物和方法進(jìn)行[8]。引物序列如表1所示。

表1 引物信息

1.5 病毒RNA提取

小腸組織按1∶2體積用PBS稀釋后勻漿，反復(fù)凍融3次；糞便按1∶2體積用PBS稀釋后充分渦旋，凍融3次；凍融好的樣品渦旋3～5 min，4℃8 000 r/min離心 10 min；取 250 μL 上清液加 750 μL RNAiso Plus，靜置5 min后加入200 μL氯仿，連續(xù)劇烈震蕩15 s后靜置2 min；4℃于1.5 mL滅菌EP管內(nèi)，4℃12 000 r/min離心15 min；吸取400 μL上清液至新EP管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，渦旋振蕩混勻，常溫靜置5 min；4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清；沉淀加入1 mL經(jīng)DEPC處理水稀釋的75%乙醇；4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清液；室溫放置5 min，沉淀用30 μL DEPC處理過的水溶解，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)

以上一步提取的病毒RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：5×Buffer 4 μL、dNTP mix 2 μL、待測樣品的 RNA 模板 2.5 μL、Ribonuclease inhibitor 0.5 μL、M-MLV 1 μL、Mg2+2 μL、Random Primer 2 μL、ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序為：42 ℃50 min；95 ℃ 5 min。PCR 反應(yīng)體系：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL、待測樣品的 cDNA 模板 2.5 μL、TaKaRa Ex Taq 0.3 μL、dNTP Mixture 1 μL、ddH2O 16.7 μL、SADS-CoV-OF 1 μL、SADS-CoV-OR 1 μL，總體積為25 μL。PCR擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s，進(jìn)行20個循環(huán)；72℃再延伸7 min。

1.7 套式PCR方法優(yōu)化

套式 PCR 反應(yīng)體系：SADS-CoV-IF 1 μL、SADS-CoV-IR 1 μL、外套PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍模板 2.5 μL、TaKaRa Ex Taq 0.3 μL、10×Ex Taq Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture 1 μL、ddH2O 16.7 μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行20個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳觀察電泳結(jié)果。用本研究建立的套式PCR檢測方法分別以PEDV、TGEV、PDCoV的基因組 DNA以及 SADSCoV的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以此檢測該方法的特異性。利用引物組對提取的SADS-CoV基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；然后采用Omega Gel Extraction Kit回收PCR產(chǎn)物作為目的片段；采用大連寶生物的pMD18-T Cloning Vector試劑盒，將上述目的片段插入pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)化及篩選，得到含插入有上述目的片段的重組質(zhì)粒的陽性克隆菌；該陽性克隆菌經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后，用天根質(zhì)粒提取試劑盒提取培養(yǎng)菌液中的質(zhì)粒，提取方法參照說明書。通過超微量分光光度計NanoDrop 2000測定提取的重組質(zhì)粒的濃度，再根據(jù)重組質(zhì)粒分子質(zhì)量和阿伏伽德羅常數(shù)將質(zhì)粒濃度換算成單位體積分子拷貝數(shù)，并將重組質(zhì)粒以1.0×108拷貝/μL為原始濃度后進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別以 1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100拷貝/μL 為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增以檢驗該檢測方法的靈敏度。以提取的SADS-CoV的基因組DNA為模板，進(jìn)行3次擴(kuò)增（間隔1周），以確定檢測結(jié)果的重復(fù)性。

1.8 江西及福建省豬群SADS-CoV臨床分子流行病學(xué)調(diào)查

利用本試驗所建立的豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒套式PCR檢測方法對采自江西7個豬場460份糞便樣品和福建1個豬場32份糞便樣品，共計492份樣品進(jìn)行檢測，以驗證該方法的實用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外引物與內(nèi)引物RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用所設(shè)計的外引物SADS-CoV OF、SADS-CoV OR進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出大小約為650 bp的片段，其大小與理論預(yù)期相符（圖1）。片段回收、克隆后進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)比對表明為SADS-CoV。用內(nèi)引物SADS-CoV IF和SADS-CoV IR對外引物擴(kuò)增的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出約291 bp大小的片段，其大小與理論預(yù)期相符（圖1）。測序結(jié)果證實所擴(kuò)增片段為SADS-CoV。

圖1 外套引物與內(nèi)套引物擴(kuò)增結(jié)果

2.2 套式PCR敏感性試驗

對以1.0×108拷貝/μL為原始濃度后進(jìn)行10倍梯度稀釋的重組質(zhì)粒進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。結(jié)果表明：本試驗所建立的豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒套式PCR檢測方法的最低檢測量為1.0×102拷貝/μL，表明所建立的PCR方法敏感性良好（圖2）。

圖2 套式PCR敏感性試驗

2.3 套式PCR特異性試驗

應(yīng)用本試驗所建立的豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒套式PCR檢測方法對PEDV、TGEV和PDCoV的檢測結(jié)果均為陰性，只有豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的PCR檢測結(jié)果呈陽性，表明該套式PCR檢測方法的特異性良好（圖3）。

圖3 套式PCR特異性試驗

2.4 套式PCR重復(fù)性試驗

利用本試驗所建立的豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒套式PCR檢測方法在不同時間點進(jìn)行測定，測定結(jié)果一致，表明本發(fā)明所述的方法重復(fù)性良好（圖4）。

圖4 套式PCR重復(fù)性試驗

2.5 臨床樣品SADS-CoV流行情況調(diào)查

用建立的套式PCR對采集自江西省7個豬場460份臨床病料進(jìn)行檢測，均未檢出SADS-CoV，從福建豬場中檢出了2份SADS-CoV陽性樣品，陽性率為6.25%（表2）。同時，還檢測了其它兩種腹瀉病毒，PEDV和PDCoV。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，492份樣品中有39份為PEDV陽性，陽性率為7.93%，其中江西臨床豬只糞便樣品中有6.96%（32/460）為PEDV陽性，福建樣品中有21.87%（7/32）為PEDV陽性。還從樣品中檢出了PDCoV，陽性率為11.59%，其中江西臨床樣品的陽性率為12.17%，福建樣品中陽性率為3.12%。

表2 臨床樣品中SADS-CoV及相關(guān)腹瀉病毒檢測結(jié)果

3 討論

2017年，Pan等從哺乳仔豬中分離到一種類似蝙蝠HKU2冠狀病毒的豬腸溶性alpha冠狀病毒，該病毒主要引起仔豬的水樣腹瀉，劇烈嘔吐、消瘦和脫水，其中5日齡以下感染仔豬死亡率達(dá)90%，8日齡以上感染仔豬死亡率低于5%。Zhou等研究結(jié)果顯示SADS-CoV至少自2016年8月起在中國出現(xiàn)，SADS-CoV的患病率僅次于PEDV，為43.53%。SADS-CoV陽性樣品中有62.2%的樣品與PEDV、TGEV和PDCoV這3種冠狀病毒中的一種或幾種發(fā)生共感染，其中與PEDV的共感染率最高，為17.65%[9]。Zhou等研究結(jié)果顯示，豬場在大規(guī)模暴發(fā)SADS-CoV之前曾暴發(fā)過PEDV，由此推測PEDV可能會促進(jìn)SADS-CoV的感染[10]。SADS-CoV感染的仔豬全腸道切片均顯示輕微的微觀病變，但嚴(yán)重程度要低于PEDV感染的仔豬，與PDCoV相比，PDCoV僅空腸和回腸有病變[11]，由此推知SADS-CoV的致病性要低于PEDV，高于PDCoV[1，12]。研究發(fā)現(xiàn)該病毒所引起的臨床癥狀與TGEV、PEDV所引起的臨床癥狀非常相似，均可使新生仔豬產(chǎn)生水樣腹瀉，劇烈嘔吐，最終脫水死亡[13-16]，這給三者的鑒別診斷帶來了很大困難，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，SADS-CoV的診斷方法主要有實時熒光定量、RT-PCR、ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）、病毒分離、免疫熒光法等。經(jīng)對比后發(fā)現(xiàn)針對N基因的qRT-PCR檢測方法靈敏度最高，且穩(wěn)定性最好。但由于TaqMan RT-PCR對設(shè)備和操作人員的技術(shù)要求較高，且成本較高，不大適合現(xiàn)今各級診斷實驗室大規(guī)模臨床檢測與流行病學(xué)調(diào)查，因此，建立一種簡單、經(jīng)濟(jì)而可靠的SADS-CoV診斷技術(shù)非常有必要[17]。套式PCR具有較高的敏感性和特異性。相對于普通PCR，套式PCR通過兩輪擴(kuò)增的方法可最大限度地降低非模板物質(zhì)、RNA樣本純凈度等因素對PCR擴(kuò)增的影響，從而獲得理想結(jié)果[18]。從特異性來看，本方法不與PEDV、PDCoV和TGEV產(chǎn)生交叉反應(yīng)，表明本方法確實是一種特異高效的診斷方法[19]。由于套式PCR需要經(jīng)過兩次擴(kuò)增，可避免因操作不當(dāng)或儀器污染等因素造成的一次擴(kuò)增出現(xiàn)的假陽性檢測結(jié)果，提高了檢測結(jié)果的可靠性。

用建立的套式PCR檢測方法對采集自江西省7個豬場460份臨床病料進(jìn)行檢測，均未檢出SADS-CoV，從福建豬場中檢出了2份SADS-CoV陽性樣品，陽性率為6.25%，目前，雖然SADS-CoV陽性檢出率不如PEDV、PDCoV陽性檢出率高。但是SADS-CoV可能會繼續(xù)發(fā)生變異，造成大規(guī)模流行。因此進(jìn)一步了解江西豬群中SADS-CoV的感染情況，追溯SADS-CoV的來源和分析各毒株間的進(jìn)化關(guān)系，以及對該病毒的分離、致病性研究，乃至疫苗開發(fā)是目前亟待開展的工作。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫的SADS-CoV基因組序列，設(shè)計了擴(kuò)增SADS-CoV基因片段的外套和內(nèi)套特異性引物，擴(kuò)增的片段大小分別為650 bp和291 bp，建立了SADS-CoV的套式PCR檢測方法。應(yīng)用所建立了的套式PCR檢測方法對采集自江西省7個豬場460份臨床病料進(jìn)行檢測，均未檢出SADS-CoV，從福建豬場中檢出了2份SADS-CoV陽性樣品，陽性率為6.25%。本研究將為調(diào)查該病毒在江西省的流行情況奠定基礎(chǔ)，為SADS-CoV所致疾病防控提供參考。