急性心肌梗死病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)及與短期預(yù)后的關(guān)系探討

趙 鵬，張彥周2，吳磊明2，李愛(ài)琴，索森森

急性心肌梗死作為是冠心病的嚴(yán)重類型，具有較高的致殘率、致死率，是導(dǎo)致死亡的主要因素[1]，嚴(yán)重威脅病人生命健康。研究表明，早期診斷及評(píng)估病人病情對(duì)改善預(yù)后具有重要意義[2]。微小RNA(micro RNA，miRNA)作為廣泛存在于生物體內(nèi)高度保守的短鏈RNA，在機(jī)體多項(xiàng)生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與多種疾病發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)，且其具有細(xì)胞和組織特異性，可穩(wěn)定存在于血液中而不被降解，已成為多種疾病的診斷指標(biāo)[3]。miR-146a作為重要的miRNA類型，在調(diào)控固有免疫及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4]，而炎癥反應(yīng)在加速血栓形成引發(fā)心肌心肌梗死中發(fā)揮重要作用[5]。本研究擬分析急性心肌梗死病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)，探討其與該病的相關(guān)性及在預(yù)后評(píng)估中的意義，以期為臨床實(shí)踐提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年2月—2016年8月在河南焦作市人民醫(yī)院心內(nèi)科治療的急性心肌梗死病人155例作為病例組，其中男88例，女67例，年齡41～77(61.58±9.02)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合國(guó)際心臟病學(xué)會(huì)及世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的關(guān)于急性心肌梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)；②發(fā)病至入院時(shí)間在12 h內(nèi)；③經(jīng)心電圖、心肌酶及冠狀動(dòng)脈造影等檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙者；②合并心功能不全、嚴(yán)重心律失常、心源性休克者；③惡性腫瘤、神經(jīng)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、急慢性炎癥者；④近半年接受過(guò)手術(shù)治療者以及臨床資料不全者。同期在我院體檢中心選取健康者60名作為對(duì)照組，其中男37名，女23名，年齡40～78(61.02±8.42)歲。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集所有研究對(duì)象性別、年齡、身高、體重、吸煙情況、血壓、血脂[總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)]等一般資料，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(BMI)，記錄急性心肌梗死病人抗凝、降脂、降壓藥物使用情況以及左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、B型鈉尿肽(BNP)等檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2 標(biāo)本采集和處理 急性心肌梗死病人于就診24 h、對(duì)照組于體檢當(dāng)日分別抽取空腹肘靜脈血6 mL，置于乙二膠四乙酸抗凝管內(nèi)，根據(jù)人淋巴細(xì)胞分離液(購(gòu)自北京達(dá)科生物技術(shù)公司)操作說(shuō)明對(duì)單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離，并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá) 取單個(gè)核細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，按Trizol總RNA提取試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)說(shuō)明提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)(購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司)檢測(cè)總RNA純度，以A260/A280在1.80～2.20為合格，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司)說(shuō)明將總RNA合成cDNA，反應(yīng)條件：40 ℃ 50 min，94 ℃ 5 min，4 ℃ 20 min。根據(jù)PCR擴(kuò)增試劑盒(購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司)說(shuō)明對(duì)引物序列配比后在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(購(gòu)自美國(guó)ABI公司)上擴(kuò)增。引物序列：miR-146a，上游5′-ATTTTACAGGGCTGGGACAG-3′，下游5′-TCTTCCAAGCTCTTCAGCAG-3′；U6，上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，76 ℃ 30 s，連續(xù)循環(huán)38次。每個(gè)樣品設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔。用2-△△Ct法計(jì)算單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 病例隨訪 所有病人順利出院，且均進(jìn)行門診或電話隨訪12個(gè)月，記錄主要不良心血管事件(MACE)發(fā)生情況，包括急性冠狀動(dòng)脈事件、心律失常、新發(fā)心力衰竭或原有心力衰竭加重、心絞痛、心源性休克或死亡等。MACE評(píng)估由心內(nèi)科具有副主任醫(yī)師職稱以上的兩位醫(yī)師完成評(píng)定。將病人分為MACE組和非MACE組。

2 結(jié) 果

2.1 病例組和對(duì)照組一般資料及外周血中miR-146a表達(dá)比較 病例組和對(duì)照組性別、年齡、BMI、吸煙、收縮壓、舒張壓、TC、TG、HDL-C和LDL-C差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，病例組外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 病例組和對(duì)照組一般資料及外周血中miR-146a表達(dá)比較

注：1 mmHg=0.133 kPa

2.2 外周血中miR-146a表達(dá)在診斷急性心肌梗死時(shí)的價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量在診斷急性心肌梗死時(shí)，曲線下面積0.964(95%CI0.942～0.986)，當(dāng)miR-146a相對(duì)表達(dá)量取界值1.65時(shí)，靈敏度為91.6%，特異度為91.7%。詳見(jiàn)圖1。

2.3 MACE組和非MACE組一般資料和外周血中miR-146a表達(dá) 隨訪12個(gè)月時(shí)，病例組發(fā)生MACE46例(29.68%)。兩組病人在性別、年齡、BMI、吸煙比例、TC、TG、HDL-C、LDL-C、阿司匹林使用比例、他汀類使用比例、氯吡格雷使用比例和ACEI/ARB使用比例方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MACE組糖尿病比例、cTnI、BNP和miR-146a表達(dá)量高于非MACE組，而高血壓比例、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)/血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)使用比例、β受體阻滯劑使用比例、LVEF低于非MACE組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

圖1 外周血中miR-146a表達(dá)在診斷急性心肌梗死時(shí)的ROC曲線

表2 MACE組和非MACE組病人一般資料和外周血中miR-146a表達(dá)比較

2.4 急性心肌梗死病人預(yù)后影響因素分析 以是否發(fā)生MACE為因變量，以單因素分析P<0.10的變量為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，對(duì)變量進(jìn)行調(diào)整后，結(jié)果顯示，cTnI、BNP和miR-146a表達(dá)量是影響急性心肌梗死病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 急性心肌梗死病人預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.5 外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)在評(píng)估病人預(yù)后時(shí)的價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量在評(píng)估病人預(yù)后時(shí)，曲線下面積0.873(95%CI0.800～0.946)，當(dāng)miR-146a相對(duì)表達(dá)量取界值1.83時(shí)，靈敏度為76.1%，特異度為90.8%。詳見(jiàn)圖2。

圖2 外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)在評(píng)估病人預(yù)后時(shí)的ROC曲線

3 討 論

急性心肌梗死作為臨床上常見(jiàn)的危重癥，起病急、進(jìn)展快、癥狀重、致死率高[6]。研究表明，急性心肌梗死治療的關(guān)鍵在于盡早恢復(fù)血流重建，心肌缺血時(shí)間>12 h，則會(huì)出現(xiàn)不可逆性損傷而增加病人死亡風(fēng)險(xiǎn)[7]。但由于部分病人早期癥狀不明顯，且約有50%的病人發(fā)病后心電圖表現(xiàn)無(wú)特異性[8]，因此，積極尋找急性心肌梗死早期診斷及病情或預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)志物已成為臨床重點(diǎn)。有研究指出，循環(huán)miRNA穩(wěn)定存在于血液中，且某些miRNA可特異性存在于心肌中[9]，為尋找急性心肌梗死診斷生物標(biāo)志物及發(fā)病機(jī)制研究提供了新方向和思路。有研究指出，冠心病病人血漿miR-126表達(dá)異常，急性心肌梗死病人中表達(dá)下降，可能是病人診斷的新型標(biāo)志物[10]。miR-146a作為與自身免疫功能及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的miRNA，在自身免疫性疾病和炎癥反應(yīng)相關(guān)疾病發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[11]，研究表明，miR-146a可能通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)而與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性關(guān)系密切[12]。本研究結(jié)果顯示，急性心肌梗死病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，而其他臨床指標(biāo)則與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明miR-146a在急性心肌梗死病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中呈高表達(dá)，可能參與了急性心肌梗死發(fā)病過(guò)程。ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量對(duì)急性心肌梗死診斷的最佳界值為1.65時(shí)，曲線下面積0.964，靈敏度91.6%，特異度91.7%，說(shuō)明miR-146a對(duì)急性心肌梗死具有一定的診斷價(jià)值，當(dāng)外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量高于1.65時(shí)應(yīng)考慮急性心肌梗死的可能。

本研究對(duì)急性心肌梗死病人隨訪12個(gè)月，發(fā)現(xiàn)46例發(fā)生了MACE，發(fā)生率29.68%，與以往研究報(bào)道結(jié)果[13-14]無(wú)差異。cTnI是目前臨床上常用的早期診斷急性心肌梗死的“金標(biāo)準(zhǔn)”[15]，BNP是近年來(lái)研究熱點(diǎn)，可作為急性心肌梗死診斷及預(yù)后評(píng)判的指標(biāo)[16]，本研究在發(fā)現(xiàn)，MACE病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a呈高表達(dá)，且血清cTnI和BNP高于非MACE組，說(shuō)明miR-146a低表達(dá)可能與MACE發(fā)生有關(guān)。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，cTnI、BNP和miR-146a表達(dá)量是影響急性心肌梗死病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明miR-146a低表達(dá)是急性心肌梗死病人預(yù)后不佳的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，ROC曲線分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量取界值1.83時(shí)，在評(píng)估病人預(yù)后時(shí)，曲線下面積0.873，靈敏度76.1%，特異度90.8%，說(shuō)明miR-146a表達(dá)對(duì)急性心肌梗死病人預(yù)后具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，可作為評(píng)估病人預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，急性心肌梗死病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a呈高表達(dá)，且與病人不良預(yù)后有關(guān)，有望成為急性心肌梗死病人診斷及預(yù)后評(píng)估的潛在標(biāo)志物。