通咽噴霧劑對(duì)短暫性大腦中動(dòng)脈栓塞模型大鼠吞咽功能的干預(yù)效應(yīng)

袁清潔1，馮學(xué)功1，劉建勛，徐 立，郝文杰1，宋文婷，姚明江，王光蕊

腦卒中是神經(jīng)源性口咽部吞咽障礙的常見(jiàn)原因[1]，腦卒中發(fā)生72 h內(nèi)有一半以上的病人存在吞咽障礙，盡管很多急性腦卒中幸存者的吞咽障礙可短期內(nèi)自發(fā)緩解，但仍有約50%的腦卒中后吞咽障礙病人吞咽功能恢復(fù)緩慢[2]。腦卒中后吞咽障礙可使吸入性肺炎等肺部并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加12倍[3]，且與營(yíng)養(yǎng)不良、脫水密切相關(guān)，嚴(yán)重影響病人和看護(hù)者的生活質(zhì)量，增加了病死率，延長(zhǎng)了住院時(shí)間。因此，盡早采取有效的治療干預(yù)有望改善病人臨床結(jié)局。目前，針灸、行為干預(yù)(包括吞咽訓(xùn)練和食物調(diào)整)、藥物、神經(jīng)肌肉電刺激、咽部電刺激、物理刺激、經(jīng)顱直流電刺激、經(jīng)顱磁刺激等吞咽療法被用來(lái)治療腦卒中后吞咽障礙。然而，除針灸、行為干預(yù)療法可減少吞咽障礙和咽部電刺激可減少咽部傳送時(shí)間外，其他吞咽療法的有效性仍不確定[4]。另外一項(xiàng)Meta分析研究顯示，針灸治療腦卒中后吞咽障礙的短期療效和安全性肯定，但遠(yuǎn)期療效尚無(wú)可靠的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持[5]，而且針灸、吞咽訓(xùn)練等的實(shí)際療效還與操作者專業(yè)技能水平[6]、病人的認(rèn)知水平及依從性等有關(guān)，故對(duì)于初涉臨床的醫(yī)師或看護(hù)人員來(lái)說(shuō)更是難以實(shí)施。

通咽噴霧劑(Tong-Yan Spray，TY Spray)是由生姜、威靈仙、肉桂三味中藥組成的復(fù)方噴霧制劑，已獲批國(guó)家發(fā)明專利(專利號(hào)ZL 2011 1 0035741.X)。在前期隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)其治療腦卒中后吞咽障礙的有效率高達(dá)71.7%，且用藥方便，可控性及穩(wěn)定性好，安全性高[7]。近年來(lái)，日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)短暫性大腦中動(dòng)脈栓塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)模型大鼠表現(xiàn)出吞咽潛伏期延長(zhǎng)和吞咽次數(shù)減少的吞咽功能改變[8-9]，提示該模型可用于腦卒中后吞咽障礙的相關(guān)研究。因此，本研究即采用這一模型，從吞咽潛伏期、吞咽次數(shù)等吞咽直接指標(biāo)和大鼠一般營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、存活狀況、體重、進(jìn)食水量等吞咽間接指標(biāo)方面，研究通咽噴霧劑對(duì)tMCAO大鼠吞咽功能的干預(yù)效應(yīng)，以期為后續(xù)研究提供借鑒與思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器、耗材、試劑 尼龍栓線(北京西濃科技有限公司2432-50A1型)，微量注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司，LSP01-1A型)；高精度張力換能器(北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司 JZ300型)；Powerlab生理實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(PowerLab/8sp，ADIstruments公司)；軟件LabChart 7.37 (Chinese)(v7 for Windows，ADIstruments公司)；小動(dòng)物麻醉機(jī)(美國(guó)MIDMARK公司，MatrxVIP3000型)；異氟烷(魯南貝特制藥有限公司，批號(hào)：64170901)。

1.2 通咽噴霧劑的組成 通咽噴霧劑以生姜、威靈仙、肉桂為原料制成。生姜辛散溫通；化痰開(kāi)竅；利咽；威靈仙通行十二經(jīng)絡(luò)，是古人治療魚骨梗喉的常用藥；再配伍以肉桂活血利咽通竅藥，共奏化痰祛瘀、利咽通竅之功。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，雄性，體重200～220 g，SPF級(jí)，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002。合格證號(hào)：11401500040369。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 通咽噴霧劑的制備 制備工藝：由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥制劑研究中心按既定工藝制作為成品(規(guī)格：每瓶25 mL，每毫升含生藥1 g)。先將生姜榨汁，備用；再將生姜渣與肉桂、威靈仙一起水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油，備用；藥渣加水煎煮，藥液過(guò)濾、濃縮，乙醇沉淀取上清藥液。精制藥液加入生姜汁、揮發(fā)油，增溶、矯味、灌裝，制得成品。

1.4.2 動(dòng)物分組及給藥 將SD大鼠分為3組：Sham組(10只)、tMCAO組(30只)、tMCAO+TY Spray組(30只)。于造模后6 h時(shí)，tMCAO+TY Spray組大鼠給予通咽噴霧劑口咽部噴霧用藥，Sham組和tMCAO組給予等量生理鹽水。每日1次，每次1噴，約0.09 mL。

1.4.3 tMCAO模型的建立 4%水合氯醛腹腔注射麻醉(1 mL/100 g)麻醉，以恒溫電熱毯將動(dòng)物體溫維持在37 ℃，仰臥位固定大鼠，沿頸部中線作縱向切口約1 cm，鈍性分離右側(cè)胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌的肌間隙，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)，依次分離右側(cè)CCA、頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)，結(jié)扎ECA、CCA近心端，并在CCA靠近ICA、ECA分叉處預(yù)留活結(jié)，動(dòng)脈夾夾閉ICA遠(yuǎn)心端。于ECA與ICA分叉處作一“V”字形切口，插入尼龍線栓，松開(kāi)ICA動(dòng)脈夾，繼續(xù)插入線栓至稍有阻力后略回撤，線栓插入深度18～22 mm，尼龍線外留約1 cm，于遠(yuǎn)心端預(yù)留活結(jié)處結(jié)扎CCA，用于固定線栓?？p合頸部切口，留置于外的尼龍線栓尾端用油性筆涂黑。90 min后將尼龍線栓輕輕提拉至略有阻力，表明線的頭端已抽出頸內(nèi)動(dòng)脈，實(shí)現(xiàn)再灌注，剪去撥出部分的線栓，完成手術(shù)。Sham組除不插入尼龍線栓外，其手術(shù)過(guò)程同模型組。

1.4.4 大鼠一般狀態(tài)、死亡率觀測(cè) 觀察一般營(yíng)養(yǎng)狀況，包括毛發(fā)光澤度、精神、日常活動(dòng)等情況，記錄死亡大鼠情況。

1.4.5 神經(jīng)功能評(píng)估 以Longa 5分制為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]：0分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀(提示無(wú)神經(jīng)功能缺損)；1分，不能完全伸展左側(cè)前爪(提示輕度局灶性神經(jīng)功能缺損)；2分，向非缺血側(cè)轉(zhuǎn)圈(提示中度局灶性神經(jīng)功能缺損)；3分，行走時(shí)向非缺血側(cè)傾倒(提示嚴(yán)重局灶性神經(jīng)功能缺損)；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)昏迷(提示意識(shí)水平低下)。

1.4.6 大鼠體重、進(jìn)食量、進(jìn)水量測(cè)定 于7 d、14 d時(shí)，記錄大鼠體重及24 h的進(jìn)食量和進(jìn)水量。

1.4.7 吞咽功能評(píng)估 于14 d時(shí)，觀測(cè)大鼠50 s內(nèi)由蒸餾水引發(fā)的吞咽潛伏期及吞咽次數(shù)。1.5%～2.0%異氟烷維持麻醉下，大鼠仰臥位固定，頸部中線切口約1 cm，暴露二腹肌前腹，高精度張力換能器一端連接二腹肌前腹，另一端與Powerlab生理實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)相連。經(jīng)大鼠口腔插入直徑0.5 mm軟管直達(dá)舌根部，使用微量注射泵以3 μL/s的速度注入蒸餾水50 s，停止1 min后，再次重復(fù)以上步驟3次，LabChart軟件記錄大鼠50 s內(nèi)的吞咽次數(shù)和從刺激開(kāi)始至第1次吞咽發(fā)生的時(shí)間即吞咽反應(yīng)時(shí)間。計(jì)算3次測(cè)量的平均數(shù)，即得平均吞咽潛伏期和吞咽次數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料若符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析one-way ANOVA；若不符合正態(tài)分布或方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

造模后6 h時(shí)，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，除去死亡大鼠及評(píng)分為0分、1分、3分、4分的大鼠，納入評(píng)分為2分的大鼠進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1 大鼠一般狀態(tài) tMCAO組、tMCAO+TY Spray組大鼠普遍表現(xiàn)為毛發(fā)干枯少澤、活動(dòng)度減低、體型瘦弱、精神狀態(tài)不佳；tMCAO+TY Spray組少部分大鼠表現(xiàn)出一般狀態(tài)略好于tMCAO組的趨勢(shì)。

2.2 不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠存活情況比較 6 h、24 h、7 d時(shí)，各組死亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；14 d時(shí)，與Sham組相比，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組死亡率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組死亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間各組大鼠存活情況

與Sham組同時(shí)間比較，1)P<0.05

2.3 大鼠體重變化情況 體重方面：各組大鼠基線體重組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；7 d、14 d時(shí)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組體重均較Sham組明顯減輕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，tMCAO組與tMCAO+TY Spray組大鼠體重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖1。體重增量/體重比較方面：7 d時(shí)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組體重增量/體重均較Sham組明顯減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，tMCAO組與tMCAO+TY Spray組大鼠體重增量/體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；14 d時(shí)，各組間大鼠體重增量/體重差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖2。

與Sham組比較，*P<0.01

與Sham組比較，*P<0.01

2.4 大鼠進(jìn)食量變化情況 進(jìn)食量方面：7 d時(shí)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組大鼠進(jìn)食量均較Sham組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組進(jìn)食量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；14 d時(shí)，tMCAO組大鼠進(jìn)食量較Sham組明顯減少(P<0.01)，tMCAO+TY Spray組與Sham組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖3。進(jìn)食量/體重方面：7 d時(shí)，各組間大鼠進(jìn)食量/體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；14 d時(shí)，tMCAO 組大鼠進(jìn)食量/體重與Sham組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，tMCAO+TY Spray組進(jìn)食量/體重較Sham組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖4。

與Sham組比較，*P<0.01

與Sham組比較，*P<0.05

2.5 大鼠進(jìn)水量變化情況 進(jìn)水量方面：7 d、14 d時(shí)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組大鼠進(jìn)水量均較Sham組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組進(jìn)水量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖5。進(jìn)水量/體重方面：7 d時(shí)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組大鼠進(jìn)水量/體重均較Sham組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；14 d時(shí)，tMCAO組大鼠進(jìn)水量/體重較Sham組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，tMCAO+TY Spray組與Sham組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與tMCAO組比較，tMCAO+TY Spray組大鼠進(jìn)水量/體重增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖6。

與Sham組比較，*P<0.01

與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01；與tMCAO組比較，#P<0.05

2.6 吞咽潛伏期、吞咽次數(shù) 14 d時(shí)，與Sham組相比，tMCAO組大鼠吞咽潛伏期延長(zhǎng)，吞咽次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；tMCAO+TY Spray組吞咽潛伏期與Sham組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，吞咽次數(shù)較Sham組增加(P<0.05)；tMCAO+TY Spray組吞咽潛伏期與tMCAO組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，tMCAO+TY Spray組吞咽次數(shù)較tMCAO組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組14 d時(shí)由蒸餾水引發(fā)的吞咽潛伏期和吞咽次數(shù)比較(±s)

與Sham組比較，1)P<0.05；與tMCAO組比，2)P<0.01

3 討 論

線栓法制備大鼠tMCAO模型具有不開(kāi)顱、對(duì)動(dòng)物生理功能影響小、梗死效果確切、重復(fù)性好、能準(zhǔn)確控制缺血及再灌注時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。本研究中觀察到tMCAO大鼠表現(xiàn)出吞咽潛伏期延長(zhǎng)和吞咽次數(shù)減少，這與前述日本學(xué)者報(bào)道的tMCAO大鼠吞咽功能改變相一致，說(shuō)明tMCAO大鼠模型應(yīng)用于研究神經(jīng)源性吞咽障礙具有較好的可行性。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)tMCAO大鼠還存在毛發(fā)干枯少澤、活動(dòng)度減低、體型瘦弱、精神狀態(tài)不佳、死亡率高、體重下降和體重增量/體重比值下降、進(jìn)食量減少、進(jìn)水量減少和進(jìn)水量/體重比值下降

等吞咽間接指標(biāo)的異常，這也與腦卒中后吞咽障礙病人的臨床表現(xiàn)相一致。通咽噴霧劑干預(yù)后，tMCAO + TY Spray組大鼠未見(jiàn)吞咽潛伏期延長(zhǎng)和吞咽次數(shù)減少，而表現(xiàn)為吞咽次數(shù)明顯增加，在進(jìn)食量/體重指標(biāo)方面雖與tMCAO大鼠相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但表現(xiàn)出較好的改善趨勢(shì)，且在14 d時(shí)的進(jìn)水量/體重與tMCAO組大鼠相比明顯增加。

由上可知，通咽噴霧劑在改善tMCAO大鼠吞咽功能方面效果明確，可有效促進(jìn)吞咽反射的恢復(fù)。另外，通咽噴霧劑在改善單位體重進(jìn)食量與單位體重進(jìn)水量方面也有一定作用，這與吞咽反射的恢復(fù)密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，在單位體重進(jìn)食量和吞咽頻率指標(biāo)方面，通咽噴霧劑干預(yù)組與Sham組相比明顯增加，考慮可能存在以下兩方面的原因：一是因吞咽頻率的增加進(jìn)而引起相應(yīng)的單位體重進(jìn)食量的增加，二是因?yàn)橥ㄑ蕠婌F劑內(nèi)含有生姜、肉桂等藥，可能促進(jìn)了tMCAO大鼠的食欲，最終導(dǎo)致了單位體重的進(jìn)食量增加。通咽噴霧劑起效的深層次機(jī)制仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究的優(yōu)點(diǎn)在于嚴(yán)格限定了納入研究的模型動(dòng)物的神經(jīng)功能評(píng)分水平，保證了研究結(jié)果的均一性及可靠性，局限性或不足是不能明確tMCAO大鼠模型中已排除的其他分值的大鼠的吞咽情況。具體來(lái)說(shuō)，本研究中僅納入了術(shù)后神經(jīng)功能缺損評(píng)分為2分的大鼠，剔除了1分和3分及以上的大鼠。主要原因在于：評(píng)分為1分的大鼠體重增長(zhǎng)速度接近Sham組或正常大鼠，如不剔除組內(nèi)大鼠體重差異較大，結(jié)果的一致性不好，不容易得出較為可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且本實(shí)驗(yàn)采用的是單側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞的方法造模，而非可以引起雙側(cè)皮質(zhì)延髓束損傷的動(dòng)物模型，評(píng)分為1分的大鼠可能表現(xiàn)不出明顯的吞咽功能障礙。若以體重、進(jìn)食水功能作為觀測(cè)指標(biāo)，考慮最好剔除評(píng)分為1分的大鼠。另外，本研究是基于文獻(xiàn)報(bào)道的新型腦卒中后吞咽障礙的大鼠模型，該模型大鼠的吞咽功能障礙發(fā)生在術(shù)后2周時(shí)，1周時(shí)尚未見(jiàn)到明顯的吞咽功能障礙。然而，評(píng)分為3分及以上的大鼠由于其神經(jīng)功能缺損較重、一般狀況更差，往往于1周內(nèi)死亡而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的偏倚，故亦將其剔除。本研究?jī)H基于以上見(jiàn)于文獻(xiàn)報(bào)道的模型制作周期和對(duì)該模型的觀察把握，僅納入了神經(jīng)功能缺損評(píng)分為2分的模型大鼠的數(shù)據(jù)，而對(duì)評(píng)分為1分或3分及以上大鼠，則需要設(shè)計(jì)更為嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)方案以進(jìn)一步驗(yàn)證。畢竟，臨床上此部分病人群體的吞咽功能障礙也是值得關(guān)注的，很有研究?jī)r(jià)值。