由細胞凋亡途徑探討參附注射液對膿毒癥小鼠心功能的影響

膿毒癥是重癥醫(yī)學科常見的急危重癥，因其發(fā)病率、住院病死率、住院費用居高不下等原因，是急危重癥醫(yī)學面臨的重要挑戰(zhàn)之一[1]。心功能障礙是膿毒癥主要并發(fā)癥之一，直接與死亡率和臨床預后密切相關(guān)。膿毒癥心功能障礙的發(fā)病機制非常復雜，既往研究主要集中在炎癥級聯(lián)反應、氧化應激、再灌注損傷等病理過程[2]。越來越多的研究表明，心肌細胞過度凋亡在膿毒癥心臟功能損害過程中發(fā)揮核心作用，尤其是其造成微循環(huán)障礙、內(nèi)皮損傷、免疫功能麻痹等，被認為是膿毒癥心功能障礙發(fā)生的重要機制[3]。中醫(yī)病因病機理論認為，“急性虛證”是膿毒癥發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，益氣溫陽治法在臨床應用中取得了滿意的效果[4]。作為益氣溫陽代表藥物，參附注射液在膿毒癥的治療中己逐漸引起人們的關(guān)注[5]。本研究擬采用國際公認的盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)構(gòu)建膿毒癥小鼠模型，采用小動物彩超評估心臟功能，蘇木精-伊紅(HE)染色評價心肌病理損傷，采用脫氧核普酸轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(TUNEL)檢測細胞凋亡，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測心臟組織中心肌損傷標記物，以初步探討參附注射液對膿毒癥模型小鼠心肌細胞凋亡和心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性C57BL6小鼠120只，體重(30±3)g，健康狀況良好，10周齡，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，合格證號：2017X119231-2。實驗環(huán)境設(shè)施合格證號：SYXK(粵)2001-00932；小鼠自由進食飲水，室內(nèi)溫度(22±2)℃，人工光暗周期12 h，所有實驗均遵循相關(guān)法律法規(guī)和廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理規(guī)范。

1.2 試劑與儀器 參附注射液購于華潤三九藥業(yè)有限公司；實驗用血清肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和B型利鈉肽(BNP)試劑盒購自上海欣普生物科技公司提供，置于4 ℃冰箱保存。碘伏、乙醇、七氟烷、生理鹽水由廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。超高分辨率小動物彩色(Visualsonics加拿大)、24道生理系統(tǒng)記錄儀(BIOPAC英國)、低溫離心機(Anke TDL-5上海)等實驗設(shè)備由廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供。

1.3 動物模型構(gòu)建與分組給藥方法 將C57BL6實驗小鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、假手術(shù)組、模型組、參附注射液組，每組30只。模型組及參附注射液組均參照國際公認方法CLP法構(gòu)建小鼠膿毒癥模型，其優(yōu)點是該模型較其他方法更符合臨床病理過程[6]。所有動物術(shù)前禁食、禁水，七氟烷麻醉后剪掉胸毛，乙醇消毒后沿前正中線切開小鼠下腹部，暴露并沿切口牽拉出盲腸約2 cm，使用8號線結(jié)扎盲腸中部，再用大號針頭穿刺回盲部1 cm處，擠出適量腸內(nèi)容物，回納盲腸至腹腔后把切口縫合，涂適量紅霉素于傷口處抗感染。

參附注射液組小鼠CLP術(shù)后第1天開始接受腹腔注射4 mL/kg參附注射液，共3 d。模型組小鼠于同一時點開始腹腔注射4 mL/kg生理鹽水，共3 d。假手術(shù)組小鼠腹部切開再縫合，不處理腸道，術(shù)后同一時點接受腹腔注射4 mL/kg生理鹽水，連續(xù)3 d。對照組小鼠不做任何處理。實驗過程中動物處置方法符合動物倫理規(guī)范和標準。

1.4 心臟彩超評價心功能 每組隨機取10只小鼠，采用Vevo 2100超高分辨率小動物超聲檢測各組小鼠左室舒張末期內(nèi)徑(LVDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVSD)，并根據(jù)內(nèi)置程序計算左室射血分數(shù)(LVEF)及左室短軸縮短率(LVFS)，取3次測量的均值并記錄[7]。

1.5 心肌損傷標記物測定 每組隨機取10只小鼠，經(jīng)實驗小鼠腹主動脈采血 1 mL，在恒定4 ℃和5 000 r/min條件下離心5 min，取上清，采用ELISA法測定血清cTnI、CK-MB和BNP濃度，所有試驗操作嚴格按照有關(guān)說明書進行。

1.6 病理染色 小鼠七氟烷麻醉后立即開胸分離心臟，切取左心室，用二甲苯浸洗3次，再用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、65%)處理1次，進行HE染色，使用OLYMPUS IMAGING觀察心臟組織病理學改變。

石蠟切片包埋脫水后，用蛋白酶K和過氧化氫室溫孵育后加入TUNEL反應液，沖洗后滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液，染色后OLYMPUS IMAGING觀察心肌細胞核呈現(xiàn)棕黃色即為凋亡細胞。使用Image J隨機選取10個視野記錄棕黃色細胞數(shù)目和細胞核總數(shù)，計算凋亡指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 心功能比較 造模72 h后，與對照組和假手術(shù)組比較，模型組小鼠心率增加，左心室肥大，表現(xiàn)為LVSD及LVDD明顯增加，左心室功能抑制，即LVEF及LVFS顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腹腔注射參附注射液3 d后，參附注射液組與模型組比較，心率、左室LVSD及LVDD下降，LVEF及LVFS提高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)，提示參附注射液可有效改善盲腸結(jié)扎穿孔小鼠心臟心肌活動從而改善心功能。詳見表1。

表1 各組小鼠心功能比較(±s)

與對照組、假手術(shù)組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.2 心肌損傷標記物水平變化 對照組和假手術(shù)組cTnI、CK-MB、BNP比較差異無統(tǒng)計學意義；模型組血清心肌損傷標記物cTnI、CK-MB和BNP濃度較對照組和假手術(shù)組均有明顯升高(P<0. 05)，參附注射液組血清心肌損傷標記物cTnI、CK-MB和BNP濃度較模型組顯著降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠心肌損傷標記物比較(±s)

與對照組、假手術(shù)組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.3 心肌組織病理改變 對照組及假手術(shù)組小鼠心肌結(jié)構(gòu)和形態(tài)無異常，細胞排列有序、致密，細胞無腫脹。模型組小鼠心臟組織出現(xiàn)明顯的病理損傷：組織結(jié)構(gòu)破壞，部分心肌細胞水腫，肌纖維排列紊亂，大量炎癥細胞浸潤明顯，且存在碎裂的細胞核。與模型組比較，參附注射液組小鼠上述心臟組織病理學損傷得到不同程度的緩解，心肌結(jié)構(gòu)尚存在，心肌細胞排列較整齊，細胞腫脹程度減輕，炎癥細胞浸潤減少，未見出現(xiàn)明顯細胞核碎裂的現(xiàn)象。詳見圖1。

圖1 各組小鼠心肌組織病理學改變(HE，×40)

2.4 各組小鼠心肌細胞凋亡情況比較 造模后72 h小鼠心肌組織TUNEL染色結(jié)果顯示：對照組和假手術(shù)組呈現(xiàn)較少心肌凋亡細胞的現(xiàn)象，而模型組和參附注射液組均出現(xiàn)不同程度的細胞凋亡，但參附注射液組凋亡的心肌細胞明顯少于模型組。根據(jù)IMAGEJ計算凋亡指數(shù)，模型組為(55.48±9.20)%，而參附注射液組為(30.12±7.30)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)，提示參附注射液具有一定的抑制膿毒癥小鼠心肌細胞凋亡的作用。詳見圖2。

圖2 各組小鼠心肌細胞凋亡情況(TUNEL，×40)

3 討 論

膿毒癥病人常常合并心功能障礙，并嚴重影響預后[8]。國外學者在20世紀80年代依據(jù)血流動力學測量數(shù)據(jù)提出感染性休克病人存在心肌頓抑的情況，影響射血分數(shù)等心臟舒張和收縮功能，表現(xiàn)為早期高代謝和晚期低動力循環(huán)的病理生理狀態(tài)，而維持正常的心功能和血流動力學是成功救治膿毒癥的關(guān)鍵[9]。本實驗證實與對照組和假手術(shù)組相比，模型組小鼠心率增加，LVEF和LVFS明顯下降，LVDD和LVSD增加，室壁活動幅度下降，提示實驗小鼠經(jīng)過CLP刺激后，超聲多普勒結(jié)果表現(xiàn)出心臟收縮舒張功能受到明顯抑制；而經(jīng)過參附注射液腹腔注射后，與模型組比較心功能顯著改善，具體表現(xiàn)為LVDD、LVSD減小，LVEF、LVFS提高。

cTnI及BNP為心肌病理性損傷的敏感指標，因其實用性廣泛應用于臨床，通過動態(tài)監(jiān)測cTnI及BNP水平和心臟彩超可以對膿毒癥預后做出判斷[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)在膿毒癥發(fā)生發(fā)展的病理生理過程中，心肌損傷標志物cTnI、CK-MB及BNP水平明顯升高，心臟HE染色病理結(jié)果也證實了心肌細胞腫脹，肌纖維撕裂、紊亂，大量中性粒細胞浸潤，部分可見嗜酸性變和空泡樣變，提示膿毒癥狀態(tài)對心肌細胞造成嚴重損傷。這與國內(nèi)外其他學者報道的膿毒癥CLP模型心臟病理性損傷結(jié)果相一致[11-12]。本研究證實膿毒癥小鼠經(jīng)過參附注射液治療后心肌損傷減輕，表現(xiàn)為心肌損傷標志物cTnI、CK-MB及BNP水平顯著下降，病理染色提示心肌細胞排列整齊、無腫脹，中性粒細胞浸潤減輕，證實參附注射液可以抑制膿毒癥心肌損傷。以往的觀點認為，控制心室率藥物如β受體阻斷劑存在負性肌力作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)在應用參附注射液治療后小鼠心率明顯減慢，但膿毒癥心功能障礙情況反而得到顯著改善，這說明參附注射液能夠抑制腎上腺素能系統(tǒng)，而進一步獲得相對穩(wěn)定的血流動力學狀態(tài)。

除此之外，參附注射液改善膿毒癥心功能狀態(tài)與減輕炎性反應、抑制心肌凋亡有關(guān)。既往研究結(jié)果表明，參附注射液可通過減少炎癥細胞因子生成來發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用[14]。細胞凋亡是機體在缺血缺氧、炎癥瀑布、氧化應激等條件下由B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)和胱天蛋白酶(Caspase)等家族基因控制的細胞自主的有序化死亡[15-16]。心肌細胞凋亡的紊亂與膿毒癥心功能障礙的發(fā)生、進展有直接關(guān)系，即膿毒癥過程中內(nèi)毒素釋放可以引起心肌細胞凋亡，引起心肌結(jié)構(gòu)和功能異常，導致心功能不全[17]。心肌細胞凋亡具有復雜的分子生物學機制，通常而言膜受體通路信號傳導系統(tǒng)傳遞凋亡信號以及激活半胱天冬蛋白酶家族成員來執(zhí)行水解底物的級聯(lián)反應。Bcl-2蛋白家族是心肌細胞凋亡過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白，其家族成員之間可形成同源二聚體，在細胞凋亡信號通路上發(fā)揮分子開關(guān)作用，促進凋亡的發(fā)生或阻遏通道的開放而抑制凋亡的啟動[18]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠在經(jīng)過盲腸結(jié)扎穿孔后Caspase-3大量表達，而參附注射液干預后Caspase-3表達下降。因Caspase-3大量表達可以激活脫氧核糖核酸酶而引起DNA片段化，其在心肌細胞凋亡過程中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3活性與心肌損傷標記物cTnI、CK-MB及BNP和心肌細胞凋亡指數(shù)變化趨勢一致，提示參附注射液可能通過抑制Caspase-3的活性從而降低膿毒癥狀態(tài)下心肌細胞凋亡的發(fā)生。

參附注射液是植物源性中藥注射劑，是臨床上常用的具有益氣溫陽作用的藥物。復習文獻表明參附注射液具有調(diào)節(jié)機體免疫，增強細胞代謝并且改善血流動力學等多方面的功效，發(fā)揮多臟器的保護作用[19-20]。本實驗證實，參附注射液可以抑制膿毒癥誘導的心肌細胞凋亡、減輕心肌病理損傷、改善心功能障礙并穩(wěn)定血流動力學參數(shù)。但參附注射液抑制心肌細胞凋亡的機制有待進一步深入研究。