腦梗死合并微出血與MMP-9基因分布異常的相關(guān)性研究

腦梗死致殘率及死亡率逐年增高，抗栓及溶栓治療是腦梗死最主要的藥物治療，然而，出血轉(zhuǎn)化是腦梗死的重要并發(fā)癥，嚴(yán)重影響腦梗死病人的預(yù)后[1]。腦微出血(cerebral microbleeds，CMBs)是一種亞臨床的腦內(nèi)微小血管病變，磁共振成像(MRI)普通序列掃描可無任何異常，僅在梯度回波及磁敏感(SWI)序列表現(xiàn)為小范圍(直徑<10 mm)圓形或斑點狀低信號[2]。即使出現(xiàn)這些影像學(xué)病灶，病人也可無任何臨床癥狀。近年來隨著磁共振磁敏感等序列的開展，CMBs被逐漸重視。臨床研究顯示在腦梗死及短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)病人中發(fā)生率可達(dá)30%以上；而在腦出血病人中CMBs發(fā)生率可超過50%[2]，且CMBs與遺傳及種族也有一定相關(guān)性，在亞洲人群中CMBs發(fā)生率較高。CMBs病人中癥狀性顱內(nèi)出血及高血壓發(fā)生率可明顯增高，越來越多的研究顯示CMBs可能是腦出血轉(zhuǎn)化的一個重要指征[2]。因此，對CMBs的研究具有重要臨床意義。關(guān)于CMBs對腦微結(jié)構(gòu)病理生理改變的機(jī)制目前仍不十分確定，CMBs對血腦屏障的破壞可能是腦組織病變的關(guān)鍵點[3]，而基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是血腦屏障的重要標(biāo)志物。因此，本研究探討腦梗死合并微出血與MMP-9基因分布異常的關(guān)聯(lián)性，為腦梗死的治療提供一定的臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年6月-2017年8月在我院神經(jīng)內(nèi)科及腦血管病科住院的急性腦梗死病人158例，其中男97例，女61例；年齡28～87(66.9±25.2)歲。對急性腦梗死病人進(jìn)行MRI常規(guī)序列(包括DWI、T1WI、T2WI及SWI)。入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～80歲；②首次患腦梗死且發(fā)病在24 h以內(nèi)；③漢族；④急性腦梗死的診斷參考“中國急性缺血性腦卒中診治指南2014”[4]并經(jīng)DWI證實；⑤CMBs在SWI序列表現(xiàn)為圓形或者橢圓形的低信號，直徑2～5 mm，在T1WI及T2WI像上無高信號表現(xiàn)，并且排除其他偽像，如蒼白球鈣化等；⑥病人或家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①顱內(nèi)血腫、顱內(nèi)腫瘤及外傷；②存在其他嚴(yán)重疾病可能導(dǎo)致隨訪脫落；③接受溶栓治療及血管內(nèi)介入治療病人；④伴有嚴(yán)重精神疾病；⑤不能耐受MRI檢查者，如心臟起搏器、金屬植入物、空間幽閉癥。根據(jù)SWI結(jié)果將病人分為CMBs組、非CMBs組。其中CMBs組66例，非CMBs組92例。

1.2 研究方法

1.2.1 基線資料收集 詳細(xì)記錄病人一般資料，如身高、體重、生活習(xí)慣、高血壓、糖尿病史、美國國立衛(wèi)生院卒中量表(NIHSS)評分及血液檢測結(jié)果。計算體質(zhì)指數(shù)。所有病人在發(fā)病24 h內(nèi)均進(jìn)行MRI檢查，包括常規(guī)T1、T2、FLAIR、DWI序列及SWI序列。

1.2.2 CMBs的診斷 采用美國通用電氣公司1.5T超導(dǎo)型磁共振掃描，使用八通道相控陣頭線圈，常規(guī)序列T2WI掃描參數(shù)：TR/TE=5 000/89，F(xiàn)LAIR掃描參數(shù)：TR/TE=9 000/89，T1WI 掃描參數(shù)：TR/TE=500/8.4。層間距4 mm，層厚6 mm，矩陣256×177，F(xiàn)OV 23 cm×20 cm，掃描16層。軸位三維磁敏感序列掃描參數(shù)：TR 49 ms/TE40 ms，反轉(zhuǎn)角15°。矩陣256×177，視野20 cm×23 cm，總掃描56層。通過實時在線技術(shù)自動生成圖像，并輸送到工作站，完成最小密度投影后進(jìn)行圖像重建處理。CMBs診斷標(biāo)準(zhǔn)為SWI可見直徑2～10 mm黑色低信號區(qū)域，規(guī)則橢圓形或圓形、密度均等、界限相對清晰，周邊無水腫。CMBs排除標(biāo)準(zhǔn)：海綿狀血管瘤、鐵沉積或鈣化及血管周圍間隙擴(kuò)張等。由兩位放射科神經(jīng)組高年資醫(yī)師獨立閱片，如意見有分歧，雙方討論后確定診斷。

1.2.3 血清MMP-9、血脂及血糖水平檢測 所有納入病人于入院后抽取空腹血5 mL，其中2 mL測定血清MMP-9水平、血脂及血糖。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清MMP-9水平。另外3 mL放入-20 ℃低溫保存，用于提取DNA。

1.2.4 基因組DNA提取 通過NaI提取法，提取外周血白細(xì)胞DNA，嚴(yán)格依照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.2.5 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)測定MMP-9基因SNP位點 根據(jù)PubMed及prim5軟件設(shè)計MMP-9 C562T引物。引物上游：5′-GCCTGGCACATAGTAGGCCC-3′；引物下游：5′-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC - 3′。

1.2.6 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系如下：總量50 μL包括正向引物1 μL、反向引物1 μL、模板DNA 8 μL、脫氧核糖核苷三磷酸4 μL、Taq聚合酶1 μL、雙蒸水30 μL、上樣緩沖液5 μL。PCR反應(yīng)控溫條件如下：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)后，72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶SphI 2 U在37 ℃環(huán)境消化3 h，然后經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳檢測MMP-9 C1562T基因型。

2 結(jié) 果

2.1 兩組病人臨床資料比較(見表 1) 兩組性別、糖尿病、總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、吸煙、飲酒、體質(zhì)指數(shù)、入院時NIHSS評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而年齡、高血壓、血清MMP-9水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示年齡、高血壓、MMP-9水平與微出血密切相關(guān)。詳見表1。

表1 兩組病人臨床資料比較

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結(jié)果 對MMP-9 C1562T 基因位點進(jìn)行檢測，CMBs組和非CMBs組中各種基因均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.681，P=0.097；χ2=2.162，P=0.249)。表明本研究樣本具有群體代表性。

2.3 兩組MMP-9基因C1562T等位基因和基因型頻率分布 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，分為3種基因型：純合子CC基因型(電泳存在435 bp一條帶)；雜合子CT基因型(電泳存在435 bp、247 bp、188 bp三條帶)；純合突變子T/T基因型(電泳存在247 bp、188 bp兩條帶)。 CMBs組MMP-9基因1562的CC、CT、TT基因型構(gòu)成比分別為63.64%、25.76%、10.61%；非CMBs組MMP-9基因1562的CC、CT、TT基因型構(gòu)成比分別為41.30%、43.48%、15.22%；兩組的基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.745，P=0.021)。CMBs組MMP-9基因1562的CC基因型頻率高于非CMBs組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.668，P=0.006)。CMBs組MMP-9基因1562的C和T等位基因頻率分別為76.52%、23.48%，非CMBs組分別為63.04%、36.96%，兩組基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.484，P= 0.011)。兩組CT+CC及CC+TT基因型分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

2.4 兩組不同基因型MMP-9血清水平比較 單因素方差分析顯示，CMBs組CC、CT和TT基因型有MMP-9水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.912，P=0.038)；非CMBs組CC、CT和TT基因型MMP-9血清水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.359，P=0.172)；CMBs組CC基因型MMP-9水平高于非CMBs組(P<0.05)。詳見表3。

表2 兩組MMP-9基因C1562T基因型分布及等位基因頻率比較 例(%)

表3 兩組不同基因型MMP-9血清水平比較(±s) ng/mL

2.5 多因素非條件Logistic回歸分析 將發(fā)生CMBs作為因變量，納入單因素分析中P<0.1的變量，將年齡、高血壓、低密度脂蛋白、入院時NIHSS評分、血清MMP-9水平作為自變量，作多因素非條件Logistic回歸分析。其中高血壓、年齡及C等位基因有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，入選主效應(yīng)模型變量。多因素非條件Logistic回歸分析顯示，高血壓、年齡及C等位基因是影響預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)。詳見表4。

表4 影響CMBs的多因素Logistic回歸

3 討 論

CMBs是一種含鐵血黃素沉積導(dǎo)致的顱內(nèi)微血管破裂，主要發(fā)生在腦動脈穿支分布區(qū)，其發(fā)生機(jī)制仍不明確，研究認(rèn)為與血腦屏障(blood brain barrier，BBB)破壞有緊密的聯(lián)系[5]。BBB由星形膠質(zhì)細(xì)胞終足、基底膜以及內(nèi)皮細(xì)胞等結(jié)構(gòu)組成，是腦組織及腦脊液與血液之間的特殊屏障，可阻止血液離子及溶質(zhì)和腦細(xì)胞之間的隨意交換，有利于維持腦組織理化環(huán)境的穩(wěn)定。CMBs病人微血管基質(zhì)膜溶解脫落，血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞外間質(zhì)明顯降解，從而導(dǎo)致血腦屏障通透性增加[6]，且隨著血腦屏障的破壞，血液成分不斷滲漏，腦出血轉(zhuǎn)化的風(fēng)險明顯增加。腦梗死病人起病后需立即進(jìn)行抗凝藥物或抗血小板聚集治療，既往研究顯示，與無微出血病人相比，抗栓或溶栓治療在微出血病人中會明顯增加腦出血性轉(zhuǎn)化風(fēng)險[7-8]。另外，已經(jīng)出現(xiàn)腦出血轉(zhuǎn)化的腦梗死病人中，多數(shù)病人起病前已經(jīng)使用過抗血小板聚集和抗凝藥物。除了可導(dǎo)致腦出血外，CMBs是認(rèn)知功能障礙的獨立危險因素[6]，CMBs病人出現(xiàn)認(rèn)知功能受損的風(fēng)險也明顯增加，CMBs病人認(rèn)知功能障礙的主要表現(xiàn)為執(zhí)行能力下降、注意力進(jìn)行性下降、視空間功能減退[9]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一種與鋅有關(guān)的金屬蛋白酶，在組織修復(fù)重塑、細(xì)胞增殖及遷徙、新生血管形成過程中發(fā)揮重要作用。其中MMP-9 是MMPs的主要家族成員，廣泛分布于腦組織的基底膜、腦血管的內(nèi)皮細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞等部位，最主要的作用是降解和重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)，使血管壁間隙擴(kuò)大，通透性增加，促使纖維蛋白等大分子透過血管間隙滲透至腦組織[10]。本研究中，單因素分析顯示，微出血與MMP-9血清水平明顯相關(guān)。既往研究也證實了MMP-9與血腦屏障破壞及腦出血轉(zhuǎn)化的相關(guān)性。Egashira等[11]研究顯示，野生型蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)小鼠白質(zhì)血腦屏障破壞(白蛋白滲漏)，MMP-9活性在SAH后24 h升高，與WT小鼠相比，SAH后MMP-9 敲除小鼠有較少的白質(zhì)T2高信號，蛛網(wǎng)膜下腔出血后第8天，正常小鼠髓鞘完整性降低，MMP-9 敲除小鼠白質(zhì)損傷減少。Castellanos等[12]研究顯示血清MMP-9水平是急性腦梗死出血轉(zhuǎn)化的獨立預(yù)測因素。Singh等[13]研究認(rèn)為，基質(zhì)金屬蛋白酶介導(dǎo)了α2-抗纖溶酶對實驗性卒中血腦屏障的破壞和缺血性腦損傷的有害影響。組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)超過時間窗內(nèi)(4.5 h)可加重缺血性卒中后出血性轉(zhuǎn)化的危險性(HT)和神經(jīng)毒性，黃芩苷可通過抑制過氧亞硝基陰離子介導(dǎo)的MMP-9活性減輕超過時間窗使用注射用阿替普酶(rtPA)導(dǎo)致的出血轉(zhuǎn)化，提高缺血性腦卒中治療的結(jié)果[14]。另有研究也認(rèn)為，緩激肽受體1R(B1R)可能通過激活ERK1/2/NF-κB通路/ MMP-9通路促進(jìn)1型糖尿病大鼠腦梗死后缺血再灌注誘導(dǎo)的血腦屏障破壞及腦出血轉(zhuǎn)化[15]。Toll樣受體4參與原位血栓性腦梗死延遲rt-PA給藥引起的出血轉(zhuǎn)化，很可能是通過增加MMP-9的表達(dá)來實現(xiàn)的[16]。

人類MMP-9基因位于16q11.2-13.1，全長7.7 kb，含13個外顯子。MMP-9 C1562T基因多態(tài)性是位于MMP-9基因轉(zhuǎn)錄啟動子上游的1562位點原有的胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)取代，該基因分布的異?？赡茉谵D(zhuǎn)錄水平改變酶蛋白生成的數(shù)量，并使該結(jié)合位點構(gòu)型出現(xiàn)改變，從而在轉(zhuǎn)錄水平與轉(zhuǎn)錄阻遏MMP-9蛋白結(jié)合的能力發(fā)生改變，導(dǎo)致啟動子的轉(zhuǎn)錄活性增高，最終促進(jìn)蛋白質(zhì)的明顯表達(dá)[17]?；趩幼邮菂⑴c特定基因轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控的重要DNA序列，MMP-9基因的分布異?？赡苤苯痈淖儼悬c基因的轉(zhuǎn)錄水平。關(guān)于MMP-9 C1562T多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性有較多研究，但是微出血與MMP-9 C1562T多態(tài)性的相關(guān)性尚未報道。既往大量研究顯示，該位點基因分布的異常可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖、血管壁細(xì)胞外基質(zhì)降解、炎性細(xì)胞的趨化和浸潤、纖維帽的破裂等病理生理變化，促進(jìn)一系列急性心腦血管事件的發(fā)生[18-19]。本研究顯示，CMBs組MMP-9 1562 C等位基因及CC基因型頻率明顯高于非CMBs組，多因素Logistic回歸分析也顯示，C等位基因是腦微出血的獨立危險因素，且CMBs組CC基因攜帶者血清MMP-9水平明顯高于CT及TT基因型。Zhang等[20]研究結(jié)果顯示，MMP-9基因-1562c / T多態(tài)性與腦卒中的出血性轉(zhuǎn)化明顯相關(guān)，并認(rèn)為，T等位基因可能是該人群出血轉(zhuǎn)化的保護(hù)因子。與本研究結(jié)果相似。然而，也有研究認(rèn)為T等位基因與出血轉(zhuǎn)化相關(guān)。劉丹等[21]研究顯示，MMP-9 C1562T的T等位基因以及MMP-2 C735T的C等位基因是腦梗死的遺傳易感基因，同時MMP-9 C1562T的T等位基因也是腦出血的遺傳易感基因。Wang等[17]研究認(rèn)為，MMP-9 C1562T 基因多態(tài)性與冠心病的發(fā)生存在顯著的種族差異性，在東亞人群中，MMP-9 1562 T等位基因與冠心病的發(fā)生明顯相關(guān)；而在西亞人群及西方人群中，MMP-9 C1562T 基因多態(tài)性與冠心病的發(fā)生無密切相關(guān)性。這些不同的基因分布與出血轉(zhuǎn)化的相關(guān)性，可能與種族、環(huán)境、生活方式相關(guān)。本研究與既往研究的差異可能與以下因素有關(guān)。首先，本研究只分析了MMP-9最典型的基因位點C1562T，MMP-9其他基因位點的分布可能也與腦微出血相關(guān)，而且既往研究也顯示，不同的基因位點的異常分布也有交互影響作用。其次，血清MMP-9水平可能與腦梗死不同階段相關(guān)，腦梗死早期的應(yīng)激反應(yīng)也可能影響MMP-9水平，因此動態(tài)監(jiān)測MMP-9水平的變化可能更能準(zhǔn)確反映MMP-9水平與腦梗死及微出血的相關(guān)性。再者，腦微出血存在輕、中、重不同程度，不同程度的微出血與MMP-9的基因分布是否相關(guān)，值得進(jìn)一步研究。最后，基因分布的異常是否與微出血病人的出血轉(zhuǎn)化及認(rèn)知功能下降等預(yù)后直接相關(guān)，也需要進(jìn)一步研究。

總之，本研究結(jié)果顯示MMP-9基因啟動子區(qū)C等位基因與腦梗死合并微出血有相關(guān)性，MMP-9基因啟動子區(qū)C等位基因可能是腦微出血的獨立危險因素，微出血病人CC基因型攜帶者M(jìn)MP-9血清水平明顯增高，這為探討CMBs的機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。