南極磷蝦脂類成分的抗炎活性研究

田曉清 ，?？∧?，2，李月月 ，2，陸亞男 ，樊成奇

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，水產(chǎn)品質(zhì)量安全與加工實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

南極磷蝦Euphausea superba脂類營(yíng)養(yǎng)成分含量豐富，其脂肪酸中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)相對(duì)含量高于15%，總磷脂含量達(dá)到油脂提取物的30%以上，南極磷蝦中還含有總蝦青素高于3 mg·100-1·g-1[1-3]。目前，南極磷蝦油(krill oil)是相關(guān)產(chǎn)品中營(yíng)養(yǎng)功效和附加值都很高的產(chǎn)品，挪威的Aker Biomarine公司開發(fā)成功的磷蝦油SKO(superbaTMkrill oil)已暢銷歐美市場(chǎng)，商業(yè)利潤(rùn)極大。

南極磷蝦油除了具有改善大腦健康、提高免疫、抗腫瘤等許多醫(yī)療保健功能外[4]，還具有一定抗炎功效[5]，但功效成分類型和作用靶點(diǎn)未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以粗磷蝦油為原料，根據(jù)脂肪酸和磷脂理化性質(zhì)差異，精制獲得不同部位，并利用體外模型進(jìn)行了抗炎活性篩選。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

不銹鋼豆?jié){機(jī)(DJ12B-DSG1型)，廣東美的精品電器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-3000)，上海亞榮生化儀器廠；低溫冷凍離心機(jī) (TS-211C)；高效液相色譜儀：Agilent 1260 HPLC，VWD可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，OpenLab CDS 色譜工作站；Shimadazu，LC-20AT pump，SIL-20A auto sampler，SPD-M20A PDA；高速逆流色譜(TBE-300C)，上海同田生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

生物材料：冰凍南極磷蝦(方磚：80 cm×40 cm×10 cm)來自2014年冬季南極磷蝦探補(bǔ)漁船，-78℃冰凍保存，使用前1周轉(zhuǎn)移至-18℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：預(yù)制GF254 TLC硅膠板(青島海洋化學(xué)公司)；液相用乙腈和甲醇(色譜級(jí)，Tedia，USA)；其余溶劑、試劑均為分析純(上海國(guó)藥集團(tuán))。

1.2 方法

1.2.1 提取

根據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)道，在室溫條件下，分別取3批次冰凍磷蝦，每批次1 200 g，采用固液比1:2.5、提取時(shí)間5 min、混合溶劑EA/BuOH比例為1:1的條件提取。真空濃縮干燥后，分別獲得磷蝦粗油48.8 g、53.2 g、49.0 g，提取率分別為4.07%、4.43%、4.08%。

1.2.2 分離和酯化

3份磷蝦粗油首先分別經(jīng)10倍體積(v·m-1)的無水乙醇沉淀除去固體雜質(zhì)，再分別用10倍體積(v·m-1)的丙酮在4℃沉淀過夜，離心分離得到淺黃色膏狀物磷蝦極性脂和深紅色透明磷蝦油。其中，分別獲得3份極性脂11.1 g、12.9 g、13.3 g，產(chǎn)率分別為22.8%、24.2%、27.2%；所得磷蝦極性脂利用HPLC(Agilent 1260)外標(biāo)法，以卵磷脂、磷脂酰乙醇胺為對(duì)照品，在206 nm測(cè)定了極性脂中磷脂總含量。獲得的深紅色透明磷蝦油分別為38.7 g、40.3 g、35.7 g，產(chǎn)率分別為77.2%、75.8%、72.8%，脂肪酸成分未作分析。

稱取40 g磷蝦油，利用乙醇鈉/乙醇回流4 h進(jìn)行乙酯化，用0.5 M的稀鹽酸中和，蒸出乙醇后用正己烷萃取、回收油相濃縮得粗輕油乙酯；進(jìn)一步利用高速逆流色譜分離提純，單次進(jìn)樣量800 mg，收集得到EPA+DHA乙酯含量較高的磷蝦輕油乙酯混合物，重復(fù)多次進(jìn)樣，合并收集的洗脫液，真空濃縮干燥后到磷蝦輕油乙酯11.3 g。并利用HPLC(Shimadazu 20AT)在215 nm歸一化法分析了磷蝦輕油乙酯純化產(chǎn)物中EPA+DHA乙酯含量。

1.2.3 抗炎活性測(cè)試

在抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO生成實(shí)驗(yàn)中，通過Griess反應(yīng)測(cè)定小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的NO生成。實(shí)驗(yàn)分為空白、對(duì)照組、LPS誘導(dǎo)模型組、受試化合物組(實(shí)驗(yàn)組)。RAW264.7細(xì)胞以5.0×105·mL-1密度接種于96孔板中，于溫度37℃，5%CO2的條件下，使用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞不做處理；LPS模型組細(xì)胞加入500 ng·mL-1LPS刺激24 h。各給藥組分別給以受試物預(yù)孵30 min，然后加入500 ng·mL-1LPS刺激24 h。取50 μL細(xì)胞上清液，依次加入等體積Griess試劑A、Griess試劑B，輕輕振蕩數(shù)次，待各孔反應(yīng)液完全混勻后，于540 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔OD值，根據(jù)公式計(jì)算NO抑制率。

采用ELISA方法檢測(cè)磷蝦極性脂、輕油、輕油乙酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW 264.7中IL-8和IL-6細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、模型組、給藥組，RAW 264.7巨噬細(xì)胞以5.0×105·mL-1密度接種于96孔板中，每孔100 μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞不做處理，模型組加LPS 500 ng·mL-1刺激24 h，分別加入相應(yīng)濃度受試物預(yù)孵30 min后，加入LPS 500 ng·mL-1刺激 24 h。IL-8，IL-6蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)曲線按照如下步驟制作：

①加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到凍干標(biāo)準(zhǔn)品IL-8或IL-6中，待徹底溶解后，靜置15 min混勻(濃度為2 000 pg·mL-1)。標(biāo)曲使用以下濃度：1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0 pg·mL-1。

②除空白孔外，分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 μL/孔)加入反應(yīng)孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃溫箱孵育90 min，用洗滌液洗板4次。

③每孔加入生物素化抗體工作液100 μL，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育60 min，洗板4次。

④每孔加入酶結(jié)合物工作液100 μL，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育30 min，洗板4次。

⑤每孔加入顯色劑 100 μL·孔-1，避光反應(yīng) 10～20 min。

⑥每孔加入終止液100 μL·孔-1，混勻后即刻測(cè)量450 nm處吸光度OD值。

⑦標(biāo)準(zhǔn)品的OD值減去空白孔的OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

收集各個(gè)受試樣品組的細(xì)胞培養(yǎng)液上清，取100 μL加入反應(yīng)孔中，設(shè)2個(gè)復(fù)孔，余下步驟同上，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每組IL-8，IL-6蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 南極磷蝦脂質(zhì)不同組分的制備

根據(jù)文獻(xiàn)分別提取3批次冰凍磷蝦，獲得磷蝦粗油提取率達(dá)到4.07%、4.43%、4.08%，稍低于文獻(xiàn)[3]報(bào)道，除所用南極磷蝦原料不同外，提示應(yīng)隨著原料用量增加，適當(dāng)延長(zhǎng)剪切提取的循環(huán)時(shí)間。

利用低溫沉淀法進(jìn)行了磷蝦粗油的分離，得到淺黃色膏狀物磷蝦極性脂和深紅色透明磷蝦輕油。其中，極性脂產(chǎn)率分別為22.8%、24.2%、27.2%，以磷脂為主，利用HPLC外標(biāo)法測(cè)得極性脂中磷脂總含量分別為53.5%、66.0%、75.4%，平均含量65.0%（標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，樣品圖譜如圖2）；磷蝦輕油產(chǎn)率分別為77.2%、75.8%、72.8%，未能檢測(cè)到卵磷脂、磷脂酰乙醇胺等磷脂成分。結(jié)果表明磷蝦粗油中，脂肪酸成分存在形式以甘油酯為主，磷脂占比較小，通過溶劑低溫沉淀，能較好地分離這兩類成分。

磷蝦輕油經(jīng)乙醇鈉/乙醇回流乙酯化反應(yīng)，萃取得粗輕油乙酯；進(jìn)一步反復(fù)利用高速逆流色譜分離提純，得到EPA+DHA乙酯含量較高的磷蝦輕油乙酯混合物，總產(chǎn)率28.25%。利用HPLC在215 nm歸一化法分析得到純化后磷蝦輕油乙酯產(chǎn)物中EPA+DHA乙酯含量為61.5%，另含十六碳烯酸、油酸乙酯分別為3.7%、5.4%（HPLC圖如圖3）。

圖1 卵磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of the phosphatidylcholine

圖2 南極磷蝦油中測(cè)得卵磷脂樣品圖Fig.2 Liquid chromatogram of phosphatidylcholine in the Antarctic krill

圖3 樣品中EPA+DHA的HPLC圖譜Fig.3 Liquid chromatogram of EPA+DHA in the Antarctic krill

2.2 南極磷蝦脂質(zhì)不同組分的抗炎活性

在抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO生成實(shí)驗(yàn)中，磷蝦極性脂、輕油、輕油乙酯在NO產(chǎn)生抑制模型中IC50分別為146.1、129.9和52.9 μg·mL-1，且都呈劑量相關(guān)性，其中輕油乙酯活性相對(duì)較好(圖1a)。

圖4 磷蝦極性脂、磷蝦油和輕油乙酯的體外抗炎活性結(jié)果Fig.4 Anti-Inflammatory Activity of polar lipid，oil and Ethyl ester fraction of light oil from Antarctic krill

采用ELISA方法檢測(cè)磷蝦極性脂、輕油、輕油乙酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW 264.7中IL-8和IL-6細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示：IL-8細(xì)胞因子含量測(cè)試中磷蝦輕油活性優(yōu)于其它2個(gè)組分 (圖4b)，IL-6細(xì)胞因子含量測(cè)試中則是輕油乙酯活性最佳(圖4c)，且都呈劑量相關(guān)性。

活性篩選結(jié)果表明：南極磷蝦油抗炎功效的主要活性成分為多不飽和脂肪酸如EPA、DHA等，脂肪酸甘油酯混合物也顯示一定的抗炎活性，而磷蝦磷脂類成分活性相對(duì)較弱。

關(guān)于南極磷蝦油改善心腦血管、提高免疫、抗腫瘤等的研究比較多[4]，抗炎活性的研究較少，主要都聚焦于總磷蝦油的體內(nèi)、體外抗炎活性[6]。本研究對(duì)磷蝦油制備得到的不同類型的成分進(jìn)行了活性跟蹤，發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)抗炎活性成分?；钚院Y選結(jié)果表明：南極磷蝦油抗炎功效的主要活性成分為多不飽和脂肪酸如EPA、DHA等，脂肪酸甘油酯混合物也顯示一定的抗炎活性，而磷蝦磷脂類成分活性相對(duì)較弱。

3 我國(guó)南極磷蝦油產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用前景

南極磷蝦蝦油中含有豐富的EPA、DHA和磷脂、蝦青素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，尤其適用于心腦血管疾病的預(yù)防和治療，因此磷蝦油產(chǎn)品附加值高，市場(chǎng)預(yù)期好。如果能進(jìn)一步精制開發(fā)細(xì)分產(chǎn)品，有望豐富產(chǎn)品類型，綜合提升產(chǎn)品附加值，適應(yīng)不同的癥狀，滿足不同的消費(fèi)需求。

本研究利用磷蝦油嘗試制備了1種抗炎有效部位小試產(chǎn)品磷蝦輕油乙酯，通過定量分析明確其中EPA+DHA乙酯含量，為61.5%，另含十六碳烯酸、油酸乙酯分別為3.7%、5.4%；體外抗炎活性結(jié)果顯示磷蝦輕油乙酯具有較強(qiáng)活性，且呈劑量相關(guān)，其抗炎作用主要表現(xiàn)為抑制炎癥因子NO、IL-6。磷蝦極性脂雖然磷脂平均含量達(dá)到65.0%，但抗炎活性微弱。

在開發(fā)南極磷蝦蝦油衍生產(chǎn)品過程中，已經(jīng)有較多相關(guān)專利[7-9]，必須考慮各類有效成分的理化特性，盡量針對(duì)性地利用低溫、真空等加工過程，在產(chǎn)品形式、制備工藝、制劑上大膽創(chuàng)新，才能最終開發(fā)出擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、品質(zhì)優(yōu)良的磷蝦油終端產(chǎn)品。本研究首次嘗試在南極磷蝦油精制過程中使用了高速逆流色譜技術(shù)[10-11]分離超低極性的油脂類化合物，較之于反相HPLC等固相色譜技術(shù)，載樣量提升較大，樣品回收率高，分離效果也達(dá)到了預(yù)期目的。

致謝：感謝中山大學(xué)藥學(xué)院尹勝教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行磷蝦極性脂、磷蝦油和輕油乙酯抗炎活性評(píng)價(jià)，感謝上海同田生物技術(shù)股份有限公司指導(dǎo)EPA+DHA乙酯的純化試驗(yàn)。