miR-34a及靶蛋白Foxp1對尋常型銀屑病的作用研究

王慧琴 王 瑤 趙宗峰 吳衛(wèi)東

銀屑病(psoriasis)是一種常見的慢性炎性皮膚病，以表皮角質(zhì)形成細胞異常增生和角化不全為主要病理改變的。目前銀屑病無法根治，并且具體的發(fā)病機制尚不明確，研究在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展中微小核糖核酸即miRNA起到了重要作用[1～3]。本研究選擇miR-34a及其靶蛋白Fxop1為研究對象，運用實時熒光定量PCR法檢測miR-34a在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達水平；在前期實驗基礎(chǔ)上培養(yǎng)HaCaT細胞，并轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物和抑制劑由此來研究下游靶蛋白Foxp1的表達是否受其調(diào)控；具體分析如下。

材料與方法

1.材料：尋常型銀屑病皮損組織選自2012～2016年在筆者醫(yī)院皮膚科就診并確診的患者12例，其中男性5例，女性7例，患者年齡19～71歲，平均年齡44.417±17.547歲；取材前未使用過相關(guān)藥物及治療；不伴有其他免疫和腫瘤疾??；排除妊娠、哺乳期等女性；以此為病例組。正常皮膚組織取自泌尿外科、整形外科、截肢者手術(shù)切除的皮膚共12例，其中男性6例，女性6例；患者年齡7～60歲，平均年齡27.500±24.333歲,以此為正常對照組，正常對照組需排除自身免疫性疾病、遺傳性疾病，并無銀屑病家族史。本研究獲筆者醫(yī)院倫理學委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

2.核酸提?。喝龃娼M織30～50mg，迅速置于研缽，倒入液氮研磨，然后根據(jù)miRNeasy Mini kit(德國Qiagen公司)說明書操作，進行核酸提取。提取的樣本總RNA用超微量核酸蛋白測定儀(美國Thermo公司)測定其濃度及純度，A260/A280比值在1.8～2.2，用于后續(xù)實驗。

3.反轉(zhuǎn)錄：使用miScript Ⅱ RT kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國Qiagen公司)，包含4種試劑5×HIFlex Buffer，10×Nucleics Mix，RT Enzyme Mix，RNase-Free H2O2；反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)在Bio-Rad C1000 Touch PCR 儀(美國Bio-Rad公司)上進行。反應(yīng)體系：5×HIFlex Buffer 4μl，10×Nucleics Mix 2μl，RT Enzyme Mix 2μl，Total RNA+ RNase-Free H2O2共 12μl。將加好試劑的EP管放置于C1000 Touch PCR儀反應(yīng)槽中，設(shè)置反應(yīng)條件：37℃ 60min，95℃ 5min。收集反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行后續(xù)實驗。

4.實時熒光定量PCR：用miScript SYBR?Green PCR kit 試劑盒(德國Qiagen公司)，包含Quantitect SYBR Green PCR Master Mix和RNase-Free H2O2兩種試劑；反應(yīng)體系為20μl：2×Quantitect SYBR Green PCR Master Mix 10μl，10×miR-34a特異性引物 2μl，10×U6 2μl，RNase-Free H2O25μl，模板 1μl。miR-34a特異性引物及U6均購自德國Qiagen公司成品。反應(yīng)在Rotor Gene-Q儀(德國 Qiagen公司)上進行，反應(yīng)條件：95℃ 15min，1個循環(huán)；94℃ 15s，55℃ 30s，70℃ 30s，40個循環(huán)。每個樣本做3個復孔，反應(yīng)結(jié)束后用Rotor-Gene Q Series Software軟件進行數(shù)據(jù)導出和分析，得出曲線及Ct值。

5.細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)HaCaT細胞(江蘇南京凱基生物技術(shù)公司)，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，加入10%胎牛血清(美國Gibco公司)，同時添加雙抗(美國Sigma公司)?；瘜W合成成品miR-34a mimic(德國Qiagen公司)和miR-34a inhibitor(德國Qiagen公司)，用Lipofectamine2000試劑盒(美國Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染時的細胞密度能夠達到30%～50%；稀釋miRNA，稀釋lipo2000輕輕混勻并室溫孵育20min；將miRNA-lipo2000 混合液加入含有細胞的500μl 培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻；培養(yǎng)4～6h后，將孔中含siRNA-lipo2000 混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基；將培養(yǎng)板置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

6.Western blot(WB)法檢測Foxp1表達：轉(zhuǎn)染成功后收集細胞，RIPA裂解細胞，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。12%分離膠進行SDS-PAGE電泳；蛋白樣本電泳分離，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5%蛋白質(zhì)干粉TBST封閉1h；TBST洗膜10min 3次，加Foxp1一抗(英國Abcam公司)1∶1000室溫孵育1h；TBST洗膜10min 3次，稀釋二抗1∶1000室溫孵育1h；TBST洗膜10min 3次，暗室曝光定影。WB實驗過程中的所有試劑除一抗外均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

結(jié) 果

1.實時熒光定量PCR檢測結(jié)果:實時熒光定量PCR以U6擴增作為參照， miR-34a擴增良好(圖1、圖2)。病例組miR-34a的表達高于正常對照組，即尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-34a呈高表達，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.047，P=0.011，表1)。

圖1 實時熒光定量PCR檢測miR-34a的擴增曲線圖

圖2 實時熒光定量PCR檢測miR-34a的溶解曲線圖

組別nmiR-34atP正常對照組120.0067±0.00213.0470.011病例組120.0243±0.0199*

與正常組織比較,*P<0.05

2.Western blot法檢測結(jié)果:培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染HaCaT細胞，轉(zhuǎn)染分為3個組，即正常對照組、miR-34a過表達組、miR-34a 抑制表達組。Western blot法檢測3組Foxp1蛋白表達結(jié)果：miR-34a過表達組Foxp1蛋白表達量高；miR-34a抑制表達組Foxp1蛋白表達量低；差異有統(tǒng)計學意義(F=286.722，P=0.000)。LSD法組間比較顯示,與正常對照組比較，miR-34a抑制表達時Foxp1蛋白表達降低(P=0.002)；與正常對照組比較，miR-34a過表達時Foxp1蛋白表達量增加(P=0.000)；miR-34a過表達組與miR-34a抑制表達組Foxp1蛋白表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000，表2、圖3)。

表2 miR-34a轉(zhuǎn)染細胞后不同組中Foxp1蛋白Western blot法檢測表達量

圖3 不同細胞轉(zhuǎn)染組中Foxp1蛋白表達水平圖

討 論

銀屑病俗稱牛皮癬，是一種多基因遺傳背景下受多因素調(diào)控的慢性炎性疾病。有研究表明,miRNA與皮膚生理、生化、免疫等許多過程均有重要相關(guān)性[2～5]。miR-34a定位于人類1p36染色體上，共有110個核甘酸序列，單獨轉(zhuǎn)錄表達[6]。研究發(fā)現(xiàn)miR-34參與了Cyclin/CDK-pRb 途徑，通過向腫瘤細胞轉(zhuǎn)染能夠引起G1期細胞周期停滯，并且miR-34與細胞周期密切相關(guān)[7]，miR-34在癌細胞中重新激活可誘發(fā)caspase調(diào)控的凋亡途徑[8]。此外，miR-34也可能與其他miRNA發(fā)揮協(xié)同作用，Bandi等發(fā)現(xiàn)miR-34a與miR-15/16共同作用誘導細胞周期阻滯，而且miR-34a及miR-15/16在腫瘤中均低表達[9]。miR-34a可通過調(diào)節(jié)其靶基因而參與細胞增殖、凋亡、存活、遷移、侵襲以及血管生成等生物過程[7,10]。因此本研究選擇miR-34a為切入點，檢測其在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達；并通過細胞培養(yǎng)進行離體研究，觀察靶蛋白Foxp1量的變化，綜合多種方法來探究二者與銀屑病發(fā)病可能的關(guān)系。

實時熒光定量PCR實驗的結(jié)果說明：miR-34a在尋常型銀屑病皮損組織中呈高表達，其與正常健康皮膚組織的差異有統(tǒng)計學意義(t=3.047，P<0.05)。禹歡歡等[1]、陳春麗等[4]、楊志波等[11]利用不同技術(shù)方法得出miR-34a在銀屑病中表達明顯上調(diào)，與本研究結(jié)果一致。筆者推測miR-34a異常表達促使表皮角質(zhì)形成細胞凋亡加速，過度增殖；細胞周期的變化使病理改變推進，因此miR-34a參與了尋常型銀屑病發(fā)病過程。

叉頭框蛋白p1(forkhead box P1，F(xiàn)OXP1)是miR-34a的重要靶基因，位于染色體3p14.1，完整編碼產(chǎn)物含677個氨基酸的蛋白，在人類組織上有廣泛的、程度不同的表達[12～14]。叉頭框蛋白P1(Foxpl)基因隸屬于FOX(forkhead box)家族的P亞族。FOX家族是一個龐大的、功能廣泛并且進化保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，其特點是具有叉頭螺旋結(jié)構(gòu)(forkhead/winged helix,FKH)[13～15]。FOX家族蛋白參與了如胚胎發(fā)育、細胞周期調(diào)控、糖類和脂類代謝、免疫調(diào)節(jié)等過程，其突變和表達異常可導致發(fā)育畸形、代謝紊亂以及腫瘤的發(fā)生等疾病[11～18]。Foxp1受miR-34a調(diào)控參與多種生物學過程，并與皮膚性疾病的生理、免疫等密切相關(guān)。有研究表明在皮膚基底細胞癌中FOXP1蛋白的陽性表達率顯著高于癌旁組織[19]。陳春麗等[16]利用免疫組化研究發(fā)現(xiàn)Foxp1蛋白表達在正常皮膚組織中的陽性率低于尋常性銀屑病皮損中的表達，且陽性主要于表皮全層細胞核表達。這與筆者轉(zhuǎn)染HaCaT細胞的研究結(jié)果一致：培養(yǎng)HaCaT細胞并轉(zhuǎn)染miR-34a mimic和miR-34a inhibitor后，Western blot法檢測結(jié)果表明，miR-34a過表達時Foxp1蛋白表達量增加；miR-34a抑制表達時Foxp1蛋白表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=286.722,P<0.01)。

綜上所述，筆者推斷在尋常型銀屑病發(fā)病過程中高表達的miR-34a通過調(diào)控其靶蛋白Foxp1參與了表皮細胞的異常增殖過程。表皮角質(zhì)形成細胞異常增生的過程說明細胞周期被打亂，細胞凋亡加速，免疫調(diào)節(jié)紊亂，由此認為miR-34a及其靶蛋白Foxp1與尋常型銀屑病的發(fā)病密切相關(guān)。