PCBP1對神經(jīng)毒素6-OHDA誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞凋亡的影響

賈冰冰 葉 夢 霍麗蓉

帕金森病是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要是以紋狀體多巴胺減少和中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元凋亡[1]。免疫炎性、線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)聚集和氧化應(yīng)激是其主要發(fā)病機制,目前對癥治療可減緩PD的進展[2]。6-OHDA可引起氧化應(yīng)激進而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[3]。有研究顯示，單側(cè)腦內(nèi)注射6-OHDA可導(dǎo)致黑質(zhì)致密體區(qū)中87%多巴胺能神經(jīng)元的破壞和同側(cè)紋狀體中85%多巴胺含量減少[4]。因此，目前6-OHDA被廣泛用于建立PD模型。小膠質(zhì)細胞主要分布于中腦黑質(zhì)。激活的小膠質(zhì)細胞可參與神經(jīng)變性疾病的發(fā)生和發(fā)展，貫穿中樞神經(jīng)系統(tǒng)整個病理變化過程。在PD動物模型中，黑質(zhì)致密體可通過小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生抗炎反應(yīng)[5～7]。

PCBP1屬于核不均一核糖核蛋白家族，是一種RNA結(jié)合蛋白，含有多聚胞嘧啶[poly(C)]特殊結(jié)合位點[8]。核不均一核糖核蛋白家族在人和小鼠組織中廣泛表達，且都含有3個KH同源域。PCBP1可通過KH同源域識別與結(jié)合poly(C)DNA,進而發(fā)揮重要生物學(xué)功能[9]。PCBP1可參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，編碼蛋白可參與主要的細胞功能如細胞增長和細胞周期的調(diào)控。為深入研究在神經(jīng)毒素作用下，過表達的PCBP1是否對BV-2細胞周期有一定影響，本研究通過構(gòu)建PCBP1重組質(zhì)粒表達載體，把PCBP1全長cDNA瞬時轉(zhuǎn)染入BV-2細胞系，并且檢測細胞周期變化，為進一步研究其功能提供可能。

材料與方法

1.材料與試劑：小鼠小膠質(zhì)細胞系BV-2(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生理室惠贈)；DMEM/F-12培養(yǎng)基，胎牛血清、1%青/鏈霉素、小提質(zhì)粒試劑盒、感受態(tài)細胞Dh5α、限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、LipHigh脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑(上海生物工程有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；PCR Master Mix(北京索萊寶生物科技有限公司)；AnnexinV/PI雙染凋亡試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)；6-OHDA(美國Sigma公司)；pEGFP/N1-PCBP1重組質(zhì)粒(本室構(gòu)建保存)。

2.pEGFP/N1-PCBP1的鑒定：以含PCBP1重組質(zhì)粒為模板，常規(guī)PCR對PCBP1的全長cDNA進行擴增，含Ecol Ⅰ酶切位點，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切、純化后與真核表達載體pEGFP-N1連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌Dh5α后,篩選出具有卡那霉素抗性陽性單克隆菌株，在液體培養(yǎng)基中搖菌進行擴增，小提質(zhì)粒后，進行DNA測序和電泳檢測。擴增PCBP1的引物，上游引物為5′-TTCTAGAATTCATGGATGCCGGTGTGACTGAAAGTG-3′；下游引物為5′-TTCTAGAATTCAACCTACACTGTTCTAGCTGCACC-3′。

3.基因轉(zhuǎn)染和6-OHDA作用兩組細胞:將對數(shù)生長期BV-2細胞按照1×105個/毫升接種于12孔板中，每孔1ml完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待細胞的匯片率達到70%～80%時，將原細胞培養(yǎng)基移去，更換為無血清培養(yǎng)基，對細胞進行饑餓處理8h時，將1.6μl pEGFP/N1-PCBP1和pEGFP/N1質(zhì)粒以及4μl高效轉(zhuǎn)染試劑分別加入100μl無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中，室溫孵育5min后，將轉(zhuǎn)染試劑加入質(zhì)粒中，室溫靜置20min，再將混合物逐滴加入細胞中，邊滴加邊搖晃培養(yǎng)皿。細胞培養(yǎng)箱中孵育8h后，更換為DMEM/F12完全培養(yǎng)基。同時設(shè)轉(zhuǎn)染pEGFP/N1-PCBP1質(zhì)粒設(shè)為實驗組、轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1質(zhì)粒為對照組。轉(zhuǎn)染 24h時，于熒光顯微鏡下觀察細胞發(fā)綠色熒光，明確PCBP1基因轉(zhuǎn)染成功后，將6-OHDA按照不同劑量(5、15、25μmol/L)作用24h和相同劑量作用不同時間(8、16、24h)的實驗方法滴加到實驗組和對照組細胞中，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別設(shè)3個復(fù)孔。

4.Annexin V/PE和7AAD雙染法檢測細胞周期：收集實驗組和對照組經(jīng)6-OHDA介導(dǎo)后的BV-2細胞，置于離心管中，5min,1000r/min常溫下進行離心。再用4℃預(yù)冷的PBS對細胞進行洗滌，重復(fù)洗滌后，用1×結(jié)合緩沖液重懸細胞，取約100μl細胞懸液加入流式管中，加入5μl Annexin V/PE混勻，室溫避光孵育5min；再加入7AAD 10μl,立即進行流式檢測。

結(jié) 果

1.重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1鑒定:重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基置于搖床上進行搖菌，提取質(zhì)粒，進行測序鑒定，結(jié)果顯示cDNA序列及插入位點均正確，詳見圖1。

圖1 DNA測序分析重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1箭頭所指為PCBP1基因插入質(zhì)粒的相應(yīng)位點

2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BV-2細胞:用重組pEGFP/N1-PCBP1和對照質(zhì)粒 pEGFP/N1分別對BV-2細胞進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，pEGFP/N1和pEGFP/N1-PCBP1可發(fā)可發(fā)出綠色熒光，詳見圖2。

圖2 pEGFP/N1及pEGFP/N1-PCBP1在BV-2細胞中的表達(×40)A.對空載質(zhì)粒pEGFP/N1在 BV-2細胞中的表達；B.重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1在 BV-2細胞中的表達

3.過表達PCBP1基因?qū)V-2細胞周期的影響:不同濃度(5～25μmol/L)6-OHDA對BV-2作用24h后，實驗組和對照組細胞早期凋亡率逐漸增加，實驗組為4.63%±1.48%、7.61%±0.39%、12.12%±0.62%；對照組為8.95%±0.47%、14.23%±0.23%、19.40%±2.42%，且實驗組和對照組比較，早期凋亡率明顯減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，晚期凋亡率無明顯變化，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1、圖3。 6-OHDA 25μmol/L作用8、16、24h后，實驗組和對照組細胞隨著時間延長，早期凋亡率逐漸增加，實驗組為6.99%±0.61%、9.40%±0.50%、12.12%±0.62%；對照組為13.03%±0.37%、15.01%±0.79%、19.40%±2.42%，但同一時間，早期凋亡率實驗組低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組細胞晚期凋亡率隨作用時間無明顯變化，兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2、圖4。

表1 不同濃度6-OHDA分別對實驗組和對照組作用24h后細胞凋亡率變化

對照組為轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP/N1的BV-2細胞；實驗組為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1的BV-2細胞。與對照組同濃度比較，*P<0.05

圖3 不同濃度6-OHDA分別對實驗組和對照組作用24h后細胞凋亡率的流式檢測結(jié)果A.對照組細胞5μmol/L 6-OHDA;B.對照組細胞15μmol/L 6-OHDA;C.對照組細胞25μmol/L 6-OHDA；D.實驗組細胞5μmol/L 6-OHDA;E.實驗組細胞15μmol/L 6-OHDA;F.實驗組細胞25μmol/L 6-OHDA；其中右上象限為晚期凋亡細胞,右下象限為早期凋亡細胞

表2 25μmol/L 6-OHDA對實驗組和對照組作用不同時間后細胞凋亡率變化

與對照組同時間比較，*P<0.05

圖4 25μmol/L 6-OHDA分別對實驗組和對照組作用不同時間后細胞凋亡率的流式檢測結(jié)果A.對照組細胞6-OHDA作用8h;B.對照組細胞6-OHDA作用16h;C.對照組細胞6-OHDA作用24h；D.實驗組細胞6-OHDA作用8h;E.實驗組細胞6-OHDA作用16h;F.實驗組細胞6-OHDA作用24h；其中右上象限為晚期凋亡細胞，右下象限為早期凋亡細胞

討 論

目前，細胞凋亡被認為是神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的機制之一，然而除了細胞壞死,神經(jīng)細胞可出現(xiàn)其他細胞死亡過程[10]。在帕金森病中，紋狀體區(qū)的多巴胺神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡和壞死[11]。有研究顯示交感神經(jīng)元暴露于多巴胺導(dǎo)致細胞收縮和核碎裂。這些結(jié)果表明帕金森病中的黑質(zhì)細胞變性可能是由于不適當?shù)亩喟桶氛T導(dǎo)的死亡，死亡的多巴胺神經(jīng)元顯示出一些細胞凋亡形態(tài)特征[12]。

PCBP1通常被稱為RNA結(jié)合蛋白，存在3個hnRNP K同源性(KH)結(jié)構(gòu)域，約70個氨基酸與RNA結(jié)合[13]。PCBP1通過與多聚胞嘧啶結(jié)合可發(fā)揮多種功能，其功能繁多復(fù)雜，包括mRNA穩(wěn)定、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯激活和剪切[14，15]。PCBP1是一種多功能蛋白分子，研究表明，PCBP1與鐵離子轉(zhuǎn)運、病毒復(fù)制、腫瘤等疾病有密切聯(lián)系，而PCBP1與神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生與發(fā)展的研究也日益增加[16～18]。神經(jīng)絲(NF)是最豐富的細胞骨架共同體，它們組成了一個有髓鞘的無脊椎動物軸突神經(jīng)元中間絲蛋白家族。通過親和純化的質(zhì)譜法，發(fā)現(xiàn)來自大鼠腦的蛋白質(zhì)鑒定出3種K-同源性(KH)結(jié)構(gòu)域RNP-hnRNP K，hnRNP E1，hnRNP E2-能夠結(jié)合NF-M RNA。hnRNPs K、E1和E2是涉及NF基因表達的重要信息轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。研究發(fā)現(xiàn)NF mRNAs確實與這些RNP內(nèi)源性結(jié)合，且其結(jié)合程度在出生后隨著神經(jīng)發(fā)育過程而發(fā)生改變，這些關(guān)聯(lián)程度的改變依賴于RNP或NF-L、M、H mRNA信息的豐富程度，同樣表明RNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用可被直接調(diào)控[19]。本課題組前期研究顯示，PCBP1可促進神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y生長，同樣證明PCBP1對神經(jīng)細胞的生長狀態(tài)具有一定的調(diào)節(jié)作用[20]。據(jù)報道，在病毒感染、細胞凋亡和熱休克過程中，細胞內(nèi)的核糖體進入位點(internal ribosome-entry site，IRES)可持續(xù)表達。Ken Nishimura等研究顯示，在IRES的翻譯中，PCBP1可與ORF57相互結(jié)合，進而增強凋亡抑制子的活性。該研究證實PCBP1主要通過IRES來調(diào)節(jié)細胞和病毒基因的表達，進而發(fā)揮抗凋亡作用。

對于PCBP1基因與神經(jīng)細胞周期變化是否存在一定的關(guān)聯(lián)鮮有深入探討。本研究通過將將重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1轉(zhuǎn)染入BV-2細胞，使其在BV-2細胞中過表達。將不同劑量6-OHDA對轉(zhuǎn)染PCBP1的BV-2細胞作用24h后，結(jié)果顯示，實驗組和對照組細胞比較，早期細胞凋亡率明顯減低(表1、圖3)。再將25μmol/L的6-OHDA分別對轉(zhuǎn)染PCBP1的實驗組和對照組細胞作用不同時間后，進行流式細胞儀檢測。結(jié)果顯示實驗組較對照組BV-2細胞的早期凋亡率同樣明顯減低(表2、圖4)。而在上述實驗中，實驗組和對照組細胞的晚期凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果提示，在神經(jīng)毒素作用條件下，PCBP1對神經(jīng)細胞周期的干預(yù)作用主要體現(xiàn)在早期凋亡階段。當神經(jīng)細胞進入晚期凋亡時期，PCBP1并不能起到有效阻斷作用。將進一步探討該蛋白阻斷神經(jīng)細胞發(fā)生早期凋亡事件的生物學(xué)機制。希望能夠為存在神經(jīng)細胞凋亡、壞死相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如PD，提供更加有效的治療手段。