MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒的性能驗(yàn)證

劉玉蘭，吳允鳳，高川川，孫艷艷

（首都醫(yī)科大學(xué)石景山教學(xué)醫(yī)院，北京市石景山醫(yī)院，北京100043）

亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性可以導(dǎo)致葉酸血藥濃度水平差異較大，通過(guò)檢測(cè)患者葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性以及葉酸和同型半胱氨酸（Hcy）的水平，評(píng)估葉酸代謝能力，可以為患者制訂個(gè)體化的葉酸補(bǔ)充方案。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委2015年頒布的《藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)技術(shù)指南（試行）》（簡(jiǎn)稱指南）要求，無(wú)論是使用經(jīng)國(guó)家藥品食品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)的試劑盒還是通過(guò)國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)試點(diǎn)單位性能評(píng)定、具有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）的自制試劑（laboratory developed test，LDT）進(jìn)行的檢測(cè)項(xiàng)目，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室在開(kāi)展臨床檢測(cè)前都需要對(duì)其進(jìn)行性能驗(yàn)證，并建立相應(yīng)的性能規(guī)范，并根據(jù)性能規(guī)范確定系統(tǒng)的校準(zhǔn)和質(zhì)控程序，保持性能特征建立、校準(zhǔn)和質(zhì)控程序相關(guān)活動(dòng)的記錄，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠［1］。同時(shí)，對(duì)選用試劑進(jìn)行性能驗(yàn)證也是北京市臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室技術(shù)評(píng)審的考核條件之一。本文旨在對(duì)該實(shí)驗(yàn)室選用的人MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒的性能進(jìn)行驗(yàn)證，以確保其性能滿足醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的要求。

資料與方法

1 一般資料

選取2017年10月來(lái)北京市石景山醫(yī)院心臟內(nèi)科門診就診的高血壓患者20例，采集患者EDTA-K2抗凝靜脈血2mL。

2 儀器與試劑

TL-988型熒光定量PCR儀（西安天隆科技有限公司），3730XL型測(cè)序儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），人MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）（蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司，國(guó)械注準(zhǔn)20173403239）及配套的核酸提取純化試劑盒。

3 方法

3.1 準(zhǔn)確性 對(duì)20例標(biāo)本的MTHFR基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，將結(jié)果與測(cè)序（金標(biāo)準(zhǔn)）結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證試劑盒的準(zhǔn)確性。

3.2 精密度 采用實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)雜合型標(biāo)本重復(fù)擴(kuò)增10次，以驗(yàn)證試劑盒的精密度。

3.3 最低檢測(cè)限 將廠家提供的雜合型DNA標(biāo)本（已知濃度為19.8ng/μL）用蒸餾水進(jìn)行倍比稀釋至檢測(cè)限（10ng/μL）下的濃度9.9 ng/μL，重復(fù)檢測(cè)3次，以驗(yàn)證試劑盒的最低檢測(cè)限。

結(jié) 果

1 準(zhǔn)確性

20例標(biāo)本的MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3，包括野生型（CC）5例，雜合突變型（CT）8例和純合突變型（TT）7例，實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全符合，符合率為100%（20/20）。

圖1 野生型CC實(shí)時(shí)熒光PCR與Sanger測(cè)序法結(jié)果比較

圖2 雜合突變型CT實(shí)時(shí)熒光PCR與Sanger測(cè)序法結(jié)果比較

圖3 純合突變型TT實(shí)時(shí)熒光PCR與Sanger測(cè)序法結(jié)果比較

2 精密度

批內(nèi)重復(fù)10次的分型檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際基因型完全相符，且所有通道的CT值變異系數(shù)CV≤5%，見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR Ct值的批內(nèi)CV（%）

3 最低檢測(cè)限

稀釋到檢測(cè)限下的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)均能準(zhǔn)確進(jìn)行分型。

討 論

研究表明，高同型半胱氨酸血癥是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［2］，其高水平可能與高血壓病的發(fā)病相關(guān)。血漿中同型半胱氨酸水平是由營(yíng)養(yǎng)狀況和遺傳因素共同決定的。而基因方面最主要的決定因素是MTHFR基因C677T基因多態(tài)性。1988年，KANG S S等［3］的研究就認(rèn)為MTHFR基因第677位堿基對(duì)上的丙氨酸替代纈氨酸的突變是一種常見(jiàn)突變，且該突變會(huì)影響血漿Hcy的代謝，導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥和低葉酸水平。

研究指出，葉酸缺乏和高Hcy與習(xí)慣性流產(chǎn)和一些不良妊娠事件（如妊娠誘發(fā)的高血壓、先兆子癇和胎盤早剝等）有關(guān)［4］。葉酸缺乏可導(dǎo)致胚胎NTD（神經(jīng)管畸形）和先天性心臟畸形［5］。ZINTZARASE等的研究肯定了MTHFR C677T基因多態(tài)性與唐氏綜合征的相關(guān)性［6］。

此外，文獻(xiàn)報(bào)道MTHFR基因677 C-T突變還是2型糖尿病、糖尿病腎病及糖尿病視網(wǎng)膜病、白血病、結(jié)腸癌、深靜脈血栓和精神焦慮、抑郁等疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子［7］。

MTHFR基因C677T基因多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致機(jī)體對(duì)葉酸的吸收代謝能力存在個(gè)體差異，使用相同劑量治療易導(dǎo)致預(yù)期療效降低或無(wú)效，因此，檢測(cè)基因多態(tài)性，估算葉酸代謝能力，并據(jù)此調(diào)整葉酸補(bǔ)充劑量的個(gè)體化用藥很有必要。

MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)屬于定性檢測(cè)項(xiàng)目，參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）制定的EP12-A2文件，定性檢測(cè)方法的性能驗(yàn)證指標(biāo)主要包括重復(fù)性/精密度、準(zhǔn)確性（突變型的檢測(cè)能力）和檢測(cè)限3個(gè)方面［8］。

依據(jù)以上要求，本文對(duì)該試劑盒進(jìn)行了準(zhǔn)確性、精密度和檢測(cè)限的驗(yàn)證。根據(jù)指南中的要求，準(zhǔn)確性的評(píng)價(jià)有兩種方法：一種是直接檢測(cè)已知標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將檢測(cè)結(jié)果與已知標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較；另一種是同時(shí)采用待評(píng)估項(xiàng)目與標(biāo)準(zhǔn)方法（或參考方法）對(duì)同一批次樣品進(jìn)行分析，比較二者的檢測(cè)結(jié)果［1］，本文采用后者，將20例標(biāo)本的MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果，與金標(biāo)準(zhǔn)-測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果完全符合；定性項(xiàng)目的精密度是指一份陽(yáng)性或陰性樣本在多次檢測(cè)中，是否能得到可重復(fù)的陽(yáng)性或陰性結(jié)果，本文中，重復(fù)擴(kuò)增10次的分型檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際基因型完全相符，且所有通道的CT值變異系數(shù)CV≤5%，表明檢測(cè)體系的重復(fù)性高；檢測(cè)限是指可被檢測(cè)體系檢出的最低檢測(cè)濃度，又稱最小檢測(cè)濃度或檢測(cè)底限，本文中，稀釋到檢測(cè)限（10ng/μL）下的濃度9.9 ng/μL的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)均能準(zhǔn)確進(jìn)行分型，表明試劑盒具有足夠的檢測(cè)能力。

通過(guò)驗(yàn)證，確認(rèn)試劑盒的性能已經(jīng)達(dá)到了生產(chǎn)商說(shuō)明書上聲稱的檢測(cè)要求，可以應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，為臨床提供準(zhǔn)確、可靠的結(jié)果。