肺癌自身抗體在腫瘤早期診斷和治療中的臨床應(yīng)用進(jìn)展

霍云麗，郭子建

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100730）

肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥死亡的主要原因，威脅著人類的健康和生命。根據(jù)相關(guān)資料及統(tǒng)計(jì)學(xué)模型估計(jì)，在2012年全球約有1.41千萬新發(fā)癌癥病例，其中肺癌發(fā)病率為180萬，占癌癥發(fā)病率的13%，是癌癥中診斷率最高的病種，也是全球男性、發(fā)達(dá)國(guó)家女性癌癥死亡率最高的病種，在發(fā)展中國(guó)家女性死亡率僅次于乳腺癌［1］。不同于西方發(fā)達(dá)國(guó)家，中國(guó)肺癌發(fā)病率從20世紀(jì)80年代初期開始一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而西方工業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家自20世紀(jì)末期開始肺癌發(fā)病率便呈下降趨勢(shì)或維持相對(duì)穩(wěn)定的水平，根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示2012年，世界范圍內(nèi)診斷為肺癌的人數(shù)大約226160，而大約有160340人死于該疾病［4］。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示中國(guó)2015年癌癥大約有新發(fā)病例429.2萬和死亡病例281.4萬，其中肺癌是發(fā)病率最高的腫瘤也居癌癥死因之首［2］。由于缺乏早期的診斷手段導(dǎo)致肺癌呈低存活率、高死亡率的特點(diǎn)，據(jù)相關(guān)報(bào)道0期肺癌患者5年生存率高達(dá)90%以上，Ⅰ期為60%，而Ⅱ期肺癌患者的5年生存率為40%，而Ⅳ期肺癌的5年生存率僅為5%［3］。目前的現(xiàn)狀是肺癌患者的5年生存率是所有癌癥中比較低的，在過去的10年里僅輕微的改善。由于肺癌早期無特異癥狀及缺少有效的早期診斷的手段，使得大多數(shù)肺癌患者被確診時(shí)已經(jīng)處于疾病后期或晚期，造成了低生存率、高死亡率的現(xiàn)狀。然而現(xiàn)有的肺癌的診斷技術(shù)主要依靠影像學(xué)即胸部X線檢查、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描、磁共振顯像（MRI）等和其他輔助檢查：組織病理學(xué)?，F(xiàn)有的影像學(xué)技術(shù)對(duì)早期癌癥的診斷作用不是很大；組織病理學(xué)取材較困難，而基礎(chǔ)研究表明體液免疫反應(yīng)往往比臨床癥狀早存在幾個(gè)月甚至是幾年，因此肺癌的自身抗體可以有效地對(duì)早期、局限性肺癌進(jìn)行篩檢，可能會(huì)增加肺癌的治愈機(jī)會(huì)［5-6］。肺癌的早期診斷可以顯著地提高生存率從晚期的3.3%提高到48.8%［7］。因此，為了能發(fā)現(xiàn)早期的肺癌患者及識(shí)別高危人群以便提供潛在的輔助治療，最終盡可能提高肺癌的生存率。目前有大量針對(duì)肺癌相關(guān)抗原的自身抗體的研究，這已經(jīng)成為近些年的研究熱點(diǎn)，肺癌的自體抗體的檢測(cè)具有早期診斷和評(píng)估預(yù)后的價(jià)值，因此自體抗體可用于肺癌患者的早期診斷［8-12］及治療。

1 與肺癌自身抗體相關(guān)的體液免疫應(yīng)答致病機(jī)制

人體的免疫系統(tǒng)能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）各種分子層面的改變?nèi)邕^表達(dá)、突變、錯(cuò)誤折疊等可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)腫瘤的自身反應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答［13］。通過TAAs刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)這些抗原的自身抗體，并可使抗原信號(hào)形成放大作用。這種機(jī)制使在肺癌早期能檢測(cè)出高表達(dá)的自身抗體成為可能，所以監(jiān)測(cè)自身抗體為臨床早期診斷提供了新的依據(jù)?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的多種自身抗體既有識(shí)別已知的蛋白，也有識(shí)別許多功能未知的功能蛋白。目前已知與抗原相關(guān)的抗體有：針對(duì)睪丸腫瘤抗原 的 抗 體 如NYESO-l、SSX2、MAGE、GAGE7、CAGE、GBU4-5；針對(duì)基因突變后引起的蛋白改變的如P53；針對(duì)分化抗原的如酪氨酸酶、SOX1、SOX2、ZIC2；針對(duì)原癌基因產(chǎn)物的如c-myc、kras；針對(duì)熱休克蛋白的Hsp-70；針對(duì)RNA結(jié)合蛋白的如Hu-C、Hu-D；針對(duì)凋亡抑制蛋白的如Survivin、livin、cIAP1以及其他如PGP9.5。

最新發(fā)現(xiàn)的自身抗體：

（1）ECH1（Delta（3，5）-Delta（2，4）-dienoyl-CoA isomerase）是ECH1基因編碼的存在于線粒體的異構(gòu)酶，是一個(gè)異構(gòu)酶超家族，與多種的異構(gòu)酶enoylcoa具有很高的序列相似性，特別是在這些酶蛋白的保守域中。該異構(gòu)酶含有c-末端的含有過氧化物酶目標(biāo)序列，并定位于過氧化物酶體上。這種酶在脂肪酸beta氧化途徑的輔助步驟中起作用［14］。ECH1在肺癌早期的表達(dá)量增高（通過使用縱向的臨床前樣本，顯示了0.763的AUC，靈敏度為60.0%，特異性為89.3%），對(duì)肺癌的早期診斷有潛在的意義［15］。

（2）HNRNPA2B1（Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1）是由位于細(xì)胞核并編碼的瓊脂糖蛋白［16］，其基因包含12個(gè)外顯子，其中包括含有36-核苷酸的編碼特殊B1蛋白質(zhì)的外顯子。該基因?qū)儆诤瞬痪鶆虻暮颂呛怂幔╤nRNPs）的亞族，其編碼的這些蛋白質(zhì)與前體mRNA的處理和加工、轉(zhuǎn)運(yùn)方面有關(guān)及具有明顯的核酸結(jié)合特性，雖然所有的hnRNPs都存在于細(xì)胞核中，但部分可能在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間移動(dòng)。HNRNPA2B1是一種自身免疫性疾病的自體抗原，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡和混合結(jié)締組織病。當(dāng)被稱為自體抗原時(shí)，HNRNPA2B1也 被 稱 為 RA33，由 HNRNPA2 和HNRNPB1蛋白質(zhì)參與包裝而新生的mRNA，在細(xì)胞質(zhì)RNA的傳輸、翻譯和穩(wěn)定中起很重要的作用。HNRNPA2和HNRNPB1也似乎在端粒的維護(hù)、細(xì)胞增殖和分化、葡萄糖運(yùn)輸中起作用。有研究顯示在肺癌中針對(duì)HNRNPA2B1的自體抗體表現(xiàn)為0.874，靈敏度為72.2%，特異性為95.5%，表現(xiàn)為與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)（rs＝-0.279，P＝0.012），證明其自身抗體的檢測(cè)有利于肺癌的早期診斷［15］。

（3）BARD1是乳腺癌易感性的主要結(jié)合蛋白BRCA1基因產(chǎn)物［18-19］，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是在細(xì)胞內(nèi)參與很多重要的生命活動(dòng)，比如與細(xì)胞生存、凋亡、DNA的修復(fù)等重要活動(dòng)，腫瘤抑制因子BRCA1相關(guān)結(jié)構(gòu)域（BARD1）在針對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)中顯示能夠預(yù)防癌癥［17］。綁定到BARD1是BRCA1抑制腫瘤活性的必不可少的組成部分，通過其異二聚體E3泛素連接酶活性導(dǎo)致腫瘤抑制［20］。BARD1是通過結(jié)合并穩(wěn)定p53的凋亡誘導(dǎo)劑［21-23］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)通過BARD1基因的選擇性剪接，其表達(dá)與在各種癌癥進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)［24-30］。這些缺乏BRCA1相互作用的N端RING結(jié)構(gòu)域的亞型在腫瘤和癌細(xì)胞系中大量表達(dá)，不但沒有腫瘤抑制功能反而具有致癌潛力［24，31-32］。BARD1亞型的過表達(dá)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，特別是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。因此，對(duì)BARD1的自身抗體檢測(cè)有利于肺癌的早期診斷。

2 自身抗體在肺癌中的檢測(cè)手段

2.1 噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)最初由SMITH［33］于1985年創(chuàng)建，該技術(shù)原理是將外源蛋白（癌細(xì)胞DNA編碼的蛋白）或隨機(jī)肽庫(kù)的多肽基因片段插入到噬菌體的外殼蛋白編碼區(qū)，通過形成融合蛋白并表達(dá)于噬菌體表面。過程是通過樣本血清與蛋白微球分步孵育以去除非特異性克隆，再經(jīng)擴(kuò)增并進(jìn)行下一輪的篩選。重復(fù)“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的過程，目的是達(dá)到抗體特異性結(jié)合的噬菌體高度富集并進(jìn)行克隆測(cè)序分析。還可以將陽(yáng)性克隆在硝酸纖維素膜進(jìn)行驗(yàn)證。目前，噬菌體肽庫(kù)展示中最常使用的噬菌體是絲狀噬菌體家族（filamentous phage family，F(xiàn)f）的如M13、f1、Fd、ft，以及溶解性噬菌體T7［34］。WU等［35］使用噬菌體T7 cDNA和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者血漿進(jìn)行生物篩選，結(jié)果鑒定出212個(gè)特異噬菌體克隆并制備蛋白芯片，并發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異性均為91.3%且AUC為0.99的5個(gè)聯(lián)合診斷NSCLC的腫瘤相關(guān)抗原（TAA）。優(yōu)點(diǎn)是所需樣本少、靈敏度高，便于自動(dòng)化、發(fā)現(xiàn)未知TAAs等，缺點(diǎn)是操作繁瑣、周期長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴等。

2.2 重組cDNA表達(dá)文庫(kù)血清學(xué)分析

重組 cDNA 表達(dá)文庫(kù)血清學(xué)分析技術(shù)（serological analysis of recombinant cDNA expression libraries，SEREX）是由SAHIN于1995年建立。該技術(shù)的過程是從新鮮組織或細(xì)胞中分離提取mRNA，通過λ噬菌體cDNA轉(zhuǎn)染到大腸肝菌內(nèi)，依次進(jìn)行轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜、與含有稀釋后的高滴度抗體的血清孵育、酶標(biāo)二抗的陽(yáng)性克隆篩選、重復(fù)篩選單克隆之后，進(jìn)行序列測(cè)定及生物學(xué)研究。目前利用SEREX 技術(shù)鑒定癌癥已經(jīng)達(dá)到至少2700種TAAs［36］，并被癌癥免疫組數(shù)據(jù)庫(kù)收錄。CHAPMAN等［37］利用SEREX 方法對(duì)82例非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）、22例小細(xì)胞肺癌（SCLC）及50例對(duì)照血清進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一組共4種肺癌潛在的血清學(xué)標(biāo)志物CAGE、NY-ESO-1、MUC1 和 GBU4-5，該 組TAAs針對(duì)肺癌的靈敏度達(dá)到64% ～92%、特異性92%～100%。優(yōu)點(diǎn)是所需樣本量少，靈敏度高，缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高、周期長(zhǎng)、無法進(jìn)行大量標(biāo)本的篩選。

2.3 血清學(xué)蛋白質(zhì)組分析

血清學(xué)蛋白質(zhì)組分析（serological proteome analysis，SERPA）是一種以蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫學(xué)原理為理論基礎(chǔ)，運(yùn)用雙相電泳、質(zhì)譜分析方法達(dá)到篩選和鑒定TAAs的一種新技術(shù)。首先將癌組織或細(xì)胞來源的蛋白使用雙相電泳方法進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再與腫瘤患者及對(duì)照血清、酶標(biāo)二抗進(jìn)行孵育、顯色，結(jié)果顯示為免疫陽(yáng)性蛋白點(diǎn)并分析比較差異點(diǎn)，最后利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定確定TAAs。優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)镾ERPA可以分析鑒定翻譯后修飾蛋白及蛋白異構(gòu)體，所以能鑒定更多的TAAs；不用構(gòu)建cDNA文庫(kù)，相對(duì)比較省時(shí)。然而，該技術(shù)最大的缺陷是雙相電泳重復(fù)較差，無法分辨分子量相近的蛋白。應(yīng)用SERPA方法，F(xiàn)ARLOW 等［38］選取117個(gè)非小細(xì)胞肺癌患者及79個(gè)正常對(duì)照血清（包括COPD組、正常組）中鑒定出次黃嘌呤核苷酸脫氫酶（IMPDH）、磷酸甘油酸酯變位酶（PGAM2）、膜聯(lián)蛋白I（ANXAI）、膜聯(lián)蛋白II（ANXAII）、HSP70-9B等5個(gè)非小細(xì)胞肺癌TAAs，該組TAAs診斷非小細(xì)胞肺癌的靈敏度為94.8%和特異性為91.1%。

2.4 蛋白芯片技術(shù)

蛋白芯片技術(shù)為一種可分析蛋白質(zhì)表達(dá)譜、研究蛋白質(zhì)之間、DNA與蛋白之間、RNA與蛋白之間的相互作用的高通量的蛋白功能分析技術(shù)。為篩選鑒定TAAs提供了一種高通量技術(shù)平臺(tái)［39］，該技術(shù)最大優(yōu)點(diǎn)是由于可平行分析大樣本且能識(shí)別翻譯后的修飾蛋白，因此能夠篩選鑒定新型的TAAs?？梢詫⒓兓蛑亟M蛋白、人工合成肽、腫瘤組織或細(xì)胞蛋白等以點(diǎn)的形式系統(tǒng)地負(fù)載于固相支持物上，然后與腫瘤陽(yáng)性血清孵育，篩選出能發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的蛋白位點(diǎn)。目前的蛋白芯片主要有玻片、多孔凝膠和微孔板3種固相支持物。這種技術(shù)可同時(shí)分析多種蛋白，尤其適用于惡性腫瘤的診斷和疫苗研究［40］。缺點(diǎn)是技術(shù)要求高、不利于普及。SHAN等［41］應(yīng)用芯片技術(shù)篩選出了一組NY-ESO-1、整合素金屬蛋白酶結(jié)合蛋白質(zhì)29（ADAM-29）、XAGE-1和黑素瘤相關(guān)抗原C1（MAGEC1）的肺癌自身抗體，并用酶聯(lián)免疫法診斷的靈敏度為33%、特異性為89%，并且這些抗原并未在正常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。

3 多個(gè)自身抗體分子的組合在肺癌早期診斷中的應(yīng)用

早期研究關(guān)注發(fā)現(xiàn)肺癌單獨(dú)的自身抗體分子檢測(cè)靈敏度和特異性都較低，最近的研究關(guān)注于多個(gè)自身抗體的聯(lián)合檢測(cè)以便來提高早期肺癌的檢出率。TANG等［42］研究中，首次進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)和薈萃分析，以評(píng)估具有潛在LC的個(gè)體血清單一或多重TAAs的診斷價(jià)值。研究結(jié)果表明，多種自身抗體的單一或不同組合可能具有不同的診斷價(jià)值，用于識(shí)別來自健康對(duì)照或良性疾病、肺癌所有階段或早期階段的患者。單一自身抗體顯示出低靈敏度，幾乎一半的個(gè)體自身抗體的診斷靈敏度低于50%。然而，多重自身抗體的組合提供了相對(duì)更高的靈敏度（30% ～100%，平均值為70.3%，中位數(shù)為77.0%），特異性為43%～97.3%，平均值為86.3%，中位數(shù)為90.5%），精度范圍為44.1%～97.6%（平均值77.7%，中位數(shù)81.2%）。因此，單一自身抗體很少能夠以足夠高的特異性和靈敏度檢測(cè)所有LC，而多種標(biāo)志物組合的檢測(cè)可以顯著提高診斷性能［43-44］。

4 自身抗體對(duì)肺癌治療的應(yīng)用前景

最近BUSHEY等［45］研究顯示根據(jù)部分癌癥患者并未發(fā)生轉(zhuǎn)移，及他們自身的宿主效應(yīng)為臨床的治療提供了新的策略。研究者之前就報(bào)道過抗補(bǔ)充因子CFH的自身抗體與早期肺癌之間的相關(guān)性。CFH通過抑制膜攻擊復(fù)合物的形成來抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)。研究者致力于將這種發(fā)現(xiàn)用于癌癥的生物學(xué)治療，通過分離肺癌患者的高親和力的自身抗體相關(guān)的B淋巴細(xì)胞，DNA表達(dá)提取抗補(bǔ)充因子CFH的自身抗體。CFH復(fù)合體的共晶體結(jié)構(gòu)顯示相對(duì)于原有結(jié)構(gòu)發(fā)生構(gòu)象變化。這種重組的CFH抗體能引起過敏反應(yīng)的激活和釋放，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞株的CDC，并抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。從單一的人類B細(xì)胞中分離出來的抗腫瘤抗體，是抗體藥物發(fā)現(xiàn)的另一種模式。

5 結(jié)局和展望

隨著腫瘤免疫的不斷發(fā)展，腫瘤的體液免疫機(jī)制揭開了它的面紗，為自身抗體在肺癌的臨床應(yīng)用提供了越來越多的理論基礎(chǔ)。作為針對(duì)肺癌的自身抗體技術(shù)本身具有比其他技術(shù)如胸部低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描（1ow-doscomputed tomography，LDCT）技術(shù)更早的檢測(cè)期，相對(duì)其他技術(shù)來說，可使患者免除大的有創(chuàng)操作，還能結(jié)合多種自身抗體的聯(lián)合檢測(cè)為患者提供高靈敏度和特異性的早期肺癌診斷；同時(shí)也有研究顯示未來自身抗體技術(shù)不僅用于肺癌的臨床早期診斷，也將用于肺癌的早期的治療?？傊覀儗硗ㄟ^不斷地對(duì)肺癌自身抗體的研究來實(shí)現(xiàn)肺癌的早期診斷及早期治療，為提高肺癌患者的生存率而努力。