添加外源菌劑對病死豬堆肥中油脂含量和氮素?fù)p失的影響

劉標(biāo)　尹紅梅　劉慧知

摘要：為了解添加外源菌劑對病死豬堆肥過程中油脂含量和氮素?fù)p失的影響，以病死豬尸體、鋸木屑為堆肥基質(zhì)，分別設(shè)置了不加外源菌劑（CK）、添加自主研制的菌劑1（T1）、添加市售菌劑2（T2）3個處理，進(jìn)行為期30 d的堆肥發(fā)酵試驗，研究堆肥過程中堆肥的基本理化性質(zhì)、各種氮素形態(tài)、油脂含量和種子發(fā)芽指數(shù)（GI）等參數(shù)變化。結(jié)果表明，外源菌劑添加對堆肥溫度無顯著影響，各堆體的高溫持續(xù)時間均能滿足堆肥無害化的要求;堆肥結(jié)束時，添加菌劑的T1和T2組的有機(jī)質(zhì)含量、硝態(tài)氮含量顯著高于對照組（CK）;添加菌劑1能夠降低堆肥的pH值和油脂含量，增加堆肥的銨態(tài)氮、全氮含量;堆肥結(jié)束時，菌劑1添加組（T1）的GI達(dá)到127.3%，顯著高于CK、T2組。由枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、木霉菌組合而成的微生物菌劑能顯著降低堆肥的油脂含量，較少氮素?fù)p失，促進(jìn)了病死豬堆肥的腐熟，具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：微生物菌劑;病死豬堆肥;油脂含量;氮素含量

中圖分類號： S141.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0240-04

我國是生豬養(yǎng)殖和消費大國，據(jù)統(tǒng)計2017年我國生豬存欄4.33億頭、出欄6.88億頭。隨著國家對生豬養(yǎng)殖行業(yè)環(huán)保要求的持續(xù)提高，生豬養(yǎng)殖規(guī)?；潭仍絹碓礁?，高密度的養(yǎng)殖模式使動物染疫和死亡的概率大大增加，據(jù)調(diào)查，每年因各類疾病引起生豬的死亡數(shù)占養(yǎng)殖總數(shù)的8%～12%[1]。病死豬如果處理不當(dāng)，將對生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重威脅[2-3]。利用堆肥法處理死畜禽成為近年來國內(nèi)外的研究熱點[4-9]，堆肥法相對于焚燒、掩埋、化制等方法，成本低、對環(huán)境污染小，且堆肥產(chǎn)品可以制成有機(jī)肥，實現(xiàn)畜禽死體的資源化處理，應(yīng)用前景廣闊。

目前，市場上沒有針對畜禽死體堆肥專用的菌劑，而利用堆體中的土著微生物或添加畜禽糞便堆肥菌劑會導(dǎo)致堆肥效率低下和堆肥產(chǎn)品質(zhì)量不佳[10]。相比畜禽糞便堆肥，病死豬堆肥過程中存在2個突出問題：（1）氮素?fù)p失和惡臭更嚴(yán)重，不僅造成空氣污染，而且降低了肥料中的氮素養(yǎng)分含量[1];（2）堆肥中的油脂含量可高達(dá)20.3%，對植物具有一定的毒性，嚴(yán)重影響堆肥產(chǎn)品的質(zhì)量[11-12]。目前，研制專門針對畜禽死體堆肥的微生物菌劑成為研究工作者的關(guān)注重點[13]。因此，本研究采用模擬堆肥試驗，研究了前期實驗室篩選出的高產(chǎn)脂肪酶菌株和除臭保氮菌株在病死豬堆肥過程中的保氮效果和降油脂效果，旨為病死豬堆肥菌劑的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，推進(jìn)堆肥法在畜禽死體無害化處理方面的推廣。

1 材料與方法

1.1 堆肥材料

試驗在湖南永安原生生物科技股份有限公司進(jìn)行，堆肥原料主要是病死豬和鋸木屑。試驗前將病死豬和鋸木屑按 3 ∶ 1 比例（鮮質(zhì)量比）投入LT-2000型無害化高速處理設(shè)備運行48 h后放料，主要目的是對病死豬及輔料進(jìn)行物理性粉碎和混勻，物料的基本理化性質(zhì)見表1。

1.2 堆肥菌劑

枯草芽孢桿菌KF-1為實驗室分離篩選獲得的具有降解油脂效果的菌株，納豆芽孢桿菌J-2為實驗室分離獲得的具有除臭效果的菌株，木霉菌Y-5為具有快速降解纖維素功能的菌株。先制備各菌株的種子液，然后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)48 h，低溫保存發(fā)酵液（活菌數(shù)均約為3.0×109 CFU/mL）。菌劑1為菌株KF-1、J-2、Y-5等體積混勻后制成的發(fā)酵液，菌劑2為商業(yè)復(fù)合有機(jī)肥發(fā)酵劑（購自江蘇綠科生物技術(shù)有限公司，活菌數(shù)約為3.0×109 CFU/g），具有促進(jìn)畜禽糞便腐熟的功能。

1.3 試驗方案

堆肥基質(zhì)為“1.1”節(jié)中經(jīng)過粉碎與混勻后的物料，各堆體總質(zhì)量約為300 kg，堆肥開始時調(diào)節(jié)各堆體的C/N約為25，含水量為55%～60%。本試驗共設(shè)3個處理：（1）對照（CK）：300 kg堆肥基質(zhì)，不添加外源菌劑;（2）試驗組T1：300 kg 堆肥基質(zhì)，加入6 L菌劑1;（3）試驗組T2：300 kg堆肥基質(zhì)，加入6 kg商業(yè)化菌劑2。將菌劑與堆肥基質(zhì)充分混勻后堆制成長、寬、高約為1.5 m×1.5 m×1.0 m的堆體，每個處理重復(fù)3堆。本次試驗于2017年6—7月在室內(nèi)大棚進(jìn)行，持續(xù)時間共30 d。每天上午10：30用水銀溫度計測定距堆體表面20 cm左右深度的溫度和同一時刻的環(huán)境溫度，分別在堆肥的7、14、21、28 d進(jìn)行機(jī)械翻堆。

1.4 測定項目及方法

分別在堆肥0、3、6、9、12、15、20、25、30 d的堆體前后左右及中心位置點進(jìn)行5點混合取樣，各堆體每次取樣量約為500 g，樣品風(fēng)干后用于各指標(biāo)的測定。pH、有機(jī)質(zhì)、全氮（TN）含量按照有機(jī)肥標(biāo)準(zhǔn)《NY 525—2012》中的方法測定，水溶性銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量分別采用靛酚藍(lán)比色法和紫外分光光度法測定[14]。

分別測定各堆體初始時間、15、20、25、30 d樣品的油脂含量和種子發(fā)芽指數(shù)（GI）。油脂含量的測定采用索氏提取法測定。種子發(fā)芽指數(shù)測定方法：取10 g各樣品加入100 mL蒸餾水浸泡，振蕩1 h后濾紙過濾。吸取6 mL濾液，加入到鋪有濾紙的培養(yǎng)皿（直徑為9 cm）中，每個培養(yǎng)皿均勻點播20粒飽滿蘿卜種子，30 ℃暗培養(yǎng)48 h，測定發(fā)芽率和根長，同時以蒸餾水為空白對照[1]。計算公式：GI=（處理的種子發(fā)芽率×處理種子根長）/（對照的種子發(fā)芽率×對照種子根長）×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行處理及作圖，利用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥溫度變化

堆體溫度變化是微生物活動的結(jié)果，是反映堆肥發(fā)酵是否正常進(jìn)行的最直觀和最重要的指標(biāo)。由圖1可知，在發(fā)酵過程中，各處理的溫度變化均呈現(xiàn)出“先升高后降低，然后保持穩(wěn)定”的趨勢。CK、T1、T2處理分別在堆肥4、3、3 d達(dá)到高溫期（>50 ℃），各堆體高溫維持時間分別為12、14、13 d。根據(jù)高溫堆肥的無害化要求（GB 7959—2012），堆溫在 50 ℃ 以上持續(xù)10 d可完全殺滅病原細(xì)菌及蟲卵，本研究所有處理均達(dá)到無害化要求。T1、T2處理與CK處理在達(dá)到高溫期的時間及高溫維持時間方面無顯著性差異，說明本試驗添加的外源菌劑對堆肥溫度無顯著的促進(jìn)作用。

2.2 堆肥pH值變化

由圖2可見，各處理的pH值均呈先升后降趨勢，這與溫度的變化趨勢類似。堆肥起始時，各堆體的pH值基本相同，隨著堆肥的進(jìn)行，由于微生物的氨化作用，導(dǎo)致堆體中有機(jī)氮分解，產(chǎn)生大量氨氮，使得pH值上升。CK、T1、T2處理pH值最大值分別出現(xiàn)在12、9、6 d，分別為7.72、7.81、7.88。此后，各堆體隨著氨化作用減弱、硝化作用增強(qiáng)，pH值下降。堆肥結(jié)束時，CK、T1、T2組pH值分別為7.23、6.65、7.06，T1處理的pH值顯著低于CK、T2處理（P<0.05）。

2.3 堆肥中有機(jī)質(zhì)含量的變化

由圖3可知，各堆體中的有機(jī)質(zhì)含量前期不斷降低，后期趨于穩(wěn)定。堆肥結(jié)束時，堆體CK、T1、T2處理的有機(jī)質(zhì)含量分別為52.4%、62.1%、59.5%，與初始相比分別下降了172、8.0、9.8百分點，添加了外源菌劑的有機(jī)質(zhì)下降幅度小于對照處理組。

2.4 堆肥中銨態(tài)氮（NH4+-N）、硝態(tài)氮（NO3--N）和全氮含量的變化

堆肥中的銨態(tài)氮含量與堆肥過程中的臭度呈正相關(guān)關(guān)系，銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨氣揮發(fā)是氮素?fù)p失的主要來源。銨態(tài)氮含量的變化，由圖4可知，各處理的銨態(tài)氮含量均表現(xiàn)為先升后降的趨勢。堆肥前期，由于具有氨化作用微生物的活動，堆肥中含氮有機(jī)物大量轉(zhuǎn)化NH4+-N，銨態(tài)氮含量大量增加。CK、T1、T2處理的峰值分別在15、15、12 d時出現(xiàn)，最大值分別為2 018.6、2 634.7、2 597.6 mg/kg。此后，伴隨著堆肥過程中氨氣揮發(fā)損失及硝化作用的增強(qiáng)，各堆體的銨態(tài)氮含量迅速下降。堆肥結(jié)束時，各處理組銨態(tài)氮含量分別降低至613.2、996.4、779.6 mg/kg，與初始量相比，降低幅度分別為46.4%、14.0%、30.7%，T1處理的銨態(tài)氮含量顯著高于對照組和T2處理（P<0.05），說明病死豬堆肥中添加菌劑1可以顯著增加堆肥中銨態(tài)氮的含量。

由圖5可知，各處理的NO3--N含量變化總體呈增加的趨勢，但在堆肥降溫期增加速率最快。堆肥結(jié)束時，CK、T1、T2處理的NO3--N含量分別為1 033.6、1 241.6、1 216.4 mg/kg，比堆肥初期分別增加了117%、172%、183%，T1、T2處理的硝態(tài)氮含量顯著高于CK處理（P<0.05）。

全氮含量是判斷有機(jī)肥效果的一個重要指標(biāo)，由圖6可知，各處理的全氮含量變化趨勢相同，均呈下降趨勢。堆肥結(jié)束時，CK、T1、T2處理的全氮含量分別為15.3、18.9、15.5 g/kg，比堆肥初期分別降低了40.2%、25.9%、40.2%。T1處理的全氮含量顯著高于對照和T2處理（P<0.05），這說明添加菌劑1，可以降低氮素?fù)p失，具有保氮效果。

2.5 堆肥油脂含量的變化

由圖7可知，堆肥的前25 d，各組的油脂含量均呈不斷降低的趨勢;25～30 d，各堆體中的油脂含量無明顯變化。堆肥結(jié)束時，T2處理的樣品由于油脂含量高，堆肥呈深褐色，而T1處理的樣品油脂含量低，顏色較T2淺（圖8）。CK、T1、T2樣品的油脂含量分別為 14.84%、7.52%、15.95%，各組的油脂降解率分別為 39.2%、70.9%、37.1%，T1的油脂含量顯著低于CK、T2的油脂含量（P<0.05）。堆肥中的油脂含量與堆肥的植物毒性密切相關(guān)，油脂含量高，會降低肥料的品質(zhì)。結(jié)果表明，添加菌劑1有利于降低堆肥中的油脂含量。

2.6 外源菌劑對種子發(fā)芽指數(shù)（GI）的影響

種子發(fā)芽指數(shù)是判斷堆肥產(chǎn)品是否腐熟的主要指標(biāo)之一，同時也能反映堆肥產(chǎn)品的植物毒性。一般認(rèn)為，當(dāng)GI>80%時，說明堆肥產(chǎn)品對植物基本無毒性，達(dá)到完全腐熟[15]。表2可知，堆肥開始時，蘿卜種子的萌發(fā)受到抑制，隨著堆肥的進(jìn)行，各組的GI逐漸增大，25 d時，T1處理的GI值達(dá)到128.9%，而CK、T2處理的GI仍小于80%。堆肥結(jié)束時，T1處理的GI達(dá)到127.3%，顯著大于CK、T2的GI（P<0.05）。

3 討論

目前，微生物菌劑在畜禽糞便、農(nóng)作物秸稈等堆肥中得到廣泛的應(yīng)用，大量研究表明，外源菌劑的添加對于堆肥的升溫、腐熟均有促進(jìn)作用。但以畜禽死體為原料的堆肥，由于原料中的氮素含量和油脂含量高，在堆肥過程中易產(chǎn)生臭味重、氮素?fù)p失量多、肥料的腐熟度低、對植物具有毒性等問題[4]。針對畜禽死體原料的性質(zhì)，篩選特定的微生物菌劑，是促進(jìn)畜禽死體堆肥腐熟、減少臭氣排放的重要途徑之一。

本試驗中對照組（CK）、添加自主研發(fā)的菌劑組（T1）和商品菌劑組（T2）在堆體最高溫度、 高溫維持天數(shù)方面無顯著性差異，均符合高溫堆肥的無害化要求（GB 7959—2012）。堆肥結(jié)束時，T1處理的pH值顯著低于CK、T2處理，推測原因可能是菌劑1中的微生物在代謝過程中產(chǎn)生了大量的酸性物質(zhì)，較低的pH值可抑制銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨氣，有利于堆肥中氮素的保持[16]。

堆肥中氮的主要形態(tài)包括有機(jī)氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和氨氣等，不同形態(tài)的氮素發(fā)生的轉(zhuǎn)化與微生物的活動密切相關(guān)。本試驗中，各處理組的銨態(tài)氮含量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢、硝態(tài)氮含量表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢，而全氮含量表現(xiàn)為逐漸降低的趨勢，這與林小鳳等報道的雞糞堆肥[17]、徐路魏等報道的蔬菜廢棄物堆肥[18]、肖禮等報道的豬糞堆肥[19]等研究中的變化趨勢一致。造成這一趨勢的原因可能是前期堆體中氨化細(xì)菌大量繁殖，有機(jī)氮大部分轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮，銨態(tài)氮含量大量上升，由于氨氣的釋放量與銨態(tài)氮含量呈正相關(guān)關(guān)系，導(dǎo)致氨氣大量揮發(fā)，全氮含量快速降低。堆肥后期，隨著堆肥溫度降低，硝化細(xì)菌大量繁殖，硝化作用增強(qiáng)，銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，因此銨態(tài)氮含量大幅減少，而硝態(tài)氮含量大量上升。堆肥后期，由于氨氣的釋放及反硝化作用（硝態(tài)氮被還原成氮氣），因此堆肥的全氮含量繼續(xù)降低。堆肥結(jié)束時，添加菌劑1的T1處理組的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和全氮含量均顯著高于CK組、T2組，說明自主研發(fā)的菌劑可以減少堆肥氮素的損失，對提高肥料的品質(zhì)具有較好效果。

與以豬糞[19]、雞糞[20]為原料的堆肥相比，本研究中各處理組在相同時間的種子發(fā)芽指數(shù)均較低，綜合分析堆肥過程中有機(jī)質(zhì)的含量及油脂的含量變化，推測造成種子發(fā)芽指數(shù)偏低的原因可能是堆體中的油脂含量高，抑制了蘿卜種子的萌發(fā)。與市場上購買的商品菌劑相比，本試驗中添加的自主研制的菌劑，能使堆肥中的油脂含量大幅降低，對于促進(jìn)堆肥的腐熟具有顯著效果。

本試驗結(jié)果顯示，在病死豬堆肥中添加以枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、木霉菌組合而成的微生物菌劑，可以顯著降低堆體中的油脂含量，減少堆肥氮素的損失，促進(jìn)堆肥的腐熟，在病死豬堆肥中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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