斑點(diǎn)叉尾血液學(xué)指標(biāo)及血細(xì)胞特點(diǎn)分析

孫翰昌　楊帆　郭玉陽

摘要：擬測定斑點(diǎn)叉尾的血液生理生化指標(biāo)及細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果表明，細(xì)胞形態(tài)豐富，包含原紅細(xì)胞、早幼紅細(xì)胞、晚幼紅細(xì)胞、紅細(xì)胞、原粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血栓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，但未檢測到嗜堿性粒細(xì)胞;谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性為（9.60±1.52） U/L，血糖濃度為（0.15±0.08） mmol/L，血清總蛋白濃度為（35.16±5.01） g/L，總膽固醇濃度為（5.37±0.77） mmol/L，白蛋白濃度為（10.92±2.27） g/L，堿性磷酸酶活性為（19.60±4.45） U/L，肌酐濃度為（37.54±2.05） μmol/L，尿素濃度為（1.26±0.20） mmol/L，總膽紅素濃度為（25.86±8.77） μmol/L。研究結(jié)果可作為斑點(diǎn)叉尾正常血液生化指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：斑點(diǎn)叉尾;血液指標(biāo);血細(xì)胞;代謝

中圖分類號(hào)： S917.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）04-0128-03

魚類血液與機(jī)體的代謝、營養(yǎng)狀況及疾病有著密切關(guān)系，可以作為評(píng)價(jià)魚類生理狀況的有效指標(biāo)，在評(píng)價(jià)魚類的營養(yǎng)狀況、健康水平、應(yīng)激反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的作用[1]。魚類的血液反映了魚類機(jī)體非特異性免疫和特異性免疫機(jī)能的變化，相關(guān)參數(shù)是診斷疾病和評(píng)價(jià)健康狀況的重要指標(biāo)，建立具有臨床意義的常規(guī)血細(xì)胞參數(shù)對(duì)魚病防治具有重要意義[2]。斑點(diǎn)叉尾（Ietalurus punetaus）又稱鉗魚，原產(chǎn)于美洲，雜食性，具有適應(yīng)能力強(qiáng)、生長迅速、抗性強(qiáng)、肉細(xì)味美、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)[3]。人們對(duì)斑點(diǎn)叉尾的研究主要聚焦于生長性能、肌肉品質(zhì)、疾病防治等方面，但關(guān)于血液生物化學(xué)方面的研究較少[4-5]。筆者通過研究斑點(diǎn)叉尾血液生化特性，可以確定其血液正常生化指標(biāo)的參考范圍，建立魚類血液生化指標(biāo)的數(shù)據(jù)庫，旨在為斑點(diǎn)叉尾的生物學(xué)研究和保護(hù)提供基礎(chǔ)的科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)魚 2016年10月13日從重慶市永川玉屏市場購得斑點(diǎn)叉尾共50尾，每尾體質(zhì)量為（500±25） g左右。實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)1周，試驗(yàn)用水為充分曝氣的自來水，充氣泵每天24 h不間斷充氧。每天按試驗(yàn)魚體質(zhì)量的3%投喂商業(yè)配合飼料，試驗(yàn)挑選活潑健康、表面無傷的20尾魚。

1.1.2 試劑、器材 魚血抗凝劑：1%肝素溶液10 mL（可抗凝血?jiǎng)┝繛?0 mL/mg，用時(shí)取5 mL血加50 μL 1%肝素）。瑞-吉染液（Wrights-Giemsas染液）：瑞氏粉1 g、吉氏粉 1 g、甘油 100 mL、甲醇400 mL，將全部染料放入乳缽內(nèi)，先加少量甲醇慢慢研磨成糊狀，使染料全部溶解，再加100 mL甘油研磨均勻，倒入潔凈的棕色瓶內(nèi)，所剩染料中再加少許甲醇進(jìn)行研磨，如此反復(fù)直至將甲醇全部用完。將配好的染液在37 ℃溫箱中放置1周，每天上下午各搖蕩1次。

染液緩沖液（pH值6.4～6.8）：1%磷酸二氫鉀溶液 30 mL，1%磷酸氫二鈉溶液20 mL，加蒸餾水至1 000 mL。

紅細(xì)胞稀釋液：NaCl（維持滲透壓）0.5 g，Na2SO4（使溶液比重增加，紅細(xì)胞均勻分布不易下沉）2.5 g，HgCl2（固定紅細(xì)胞并防腐）0.25 g，加蒸餾水至100 mL。

白細(xì)胞稀釋液：冰醋酸（破壞紅細(xì)胞）1.5 mL，1.1%龍膽紫（染白細(xì)胞核，便于計(jì)數(shù)）1 mL，加蒸餾水至100 mL。

器材：Neubauer計(jì)數(shù)板（或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板）;日本東芝TMS-1024H型全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑;E600生物顯微鏡。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 采血 5 mL離心管經(jīng)1%肝素鈉濕潤后干燥備用，魚體用尾靜脈斷尾采血法采集血液5 mL。

1.2.2 生理指標(biāo)檢測 取3 mL血液，于56 ℃水浴2 h，5 000 r/min 離心10 min，取上清于500 μL于日本東芝 TMS-1024H型全自動(dòng)生化分析儀測定血液學(xué)指標(biāo)。用丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試劑盒（IFCC法）檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，用苦味酸法檢測肌酐，用血糖測定試劑盒（GOD-PAP法）測血糖，用AMP法檢測檢測堿性磷酸酶，用Doumas法測總蛋白，用BCG法測定白蛋白，用UV-GLDH法測尿素，用COD-CE-PAP法測定總膽固醇，氧化法檢測總膽紅素，試驗(yàn)中所用到的試劑盒均購自四川省邁克科技有限責(zé)任公司。

1.2.3 光鏡樣品制備 取1滴血滴于干凈無油脂的玻片一端，推片形成均勻血膜，將玻片自然晾干。為防止血膜脫落，先用甲醇固定2～3 min，干燥后用瑞-吉染液染色，于油鏡下觀察并拍照。

1.2.4 血細(xì)胞計(jì)數(shù) 紅細(xì)胞（RBC）計(jì)數(shù)：紅細(xì)胞稀釋液 3.98 mL，加入抗凝血20 μL，使血液稀釋200倍，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，其計(jì)算公式為：紅細(xì)胞數(shù)（103個(gè)/mL）=5個(gè)中格紅細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)/計(jì)數(shù)室的5個(gè)中方格的體積。

白細(xì)胞數(shù)（WBC）計(jì)數(shù)：白細(xì)胞稀釋液0.38 mL，加入抗凝血20 μL，使血液稀釋20倍，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)四角的4個(gè)大方格內(nèi)的白細(xì)胞，將其總數(shù)乘以50，即得紅細(xì)胞數(shù)（103個(gè)/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液指標(biāo)測定

斑點(diǎn)叉尾的血液指標(biāo)測定結(jié)果如表1所示?？梢钥闯?，受試斑點(diǎn)叉尾的ALT值為9.60 U/L，GLU值為 0.15 mmol/L，TP值為35.16 g/L，CHOL值為5.37 mmol/L，ALB值為10.92 g/L，ALP值為19.6 U/L，Cre值為 37.54 μmol/L，BUN值為 1.26 mmol/L，Tbi值為25.86 μmol/L，除血清中總蛋白（TP）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBi）有較大的變化范圍外，其他值偏差均不大。

2.2 血細(xì)胞形態(tài)觀察

原紅細(xì)胞。細(xì)胞圓形或橢圓形，胞體較大，胞質(zhì)較少，染成深藍(lán)色，不透明且著色均勻。胞核大，占細(xì)胞的大部分，居中或偏于細(xì)胞一側(cè)，核膜清晰，核仁可見，有凹陷感。核內(nèi)染色質(zhì)較濃，染成紫紅色，呈粗粒狀。胞核周圍有淺紅色的環(huán)核帶區(qū)存在（圖1-1）。

早幼紅細(xì)胞。細(xì)胞圓形或橢圓形，胞體胞核均較原紅細(xì)胞的小，但核質(zhì)比仍較大，核內(nèi)染色質(zhì)呈紫紅色。胞質(zhì)顏色淺藍(lán)色或灰藍(lán)色，核內(nèi)染色質(zhì)逐漸變粗，胞質(zhì)出現(xiàn)血紅蛋白，核膜明顯，核內(nèi)染色質(zhì)更粗糙（圖1-2）。

晚幼紅細(xì)胞。細(xì)胞圓形或橢圓形，胞質(zhì)染成橘黃色至橘紅色，核更致密。細(xì)胞體積較成熟紅細(xì)胞的體積稍大，胞核圓或橢圓形，胞質(zhì)血紅蛋白豐富而呈現(xiàn)橘紅色，胞核周圍著色稍淺（圖1-3）。

紅細(xì)胞。胞體圓形或橢圓形，光滑無胞突，胞核中位或稍偏，胞核圓形或橢圓形，染色質(zhì)致密呈團(tuán)塊狀，染成深紫紅色，沿核周圍或中央分布，胞質(zhì)豐富（圖1-4）。

原粒細(xì)胞。與原紅細(xì)胞相似，但原粒細(xì)胞胞質(zhì)嗜堿性稍弱，染色質(zhì)呈更細(xì)的粒狀。胞體圓形或卵圓形，胞質(zhì)量少，染成藍(lán)色，著色均勻透明無顆粒。核質(zhì)比例大，約為2/3～4/5。胞核圓形或橢圓形，居中或稍偏一側(cè)，核染色質(zhì)呈紫紅色細(xì)沙粒狀均勻分布，核仁可見有外凸感（圖1-6、圖1-21）。

嗜酸性粒細(xì)胞。相對(duì)而言，這類細(xì)胞數(shù)量較少。細(xì)胞圓形或不規(guī)則圓形，細(xì)胞核有圓形、分葉形及不規(guī)則形。核染成暗紫紅色，周圍細(xì)胞質(zhì)中有明顯的紅色大顆粒。（圖1-7、圖1-8）。

單核細(xì)胞。細(xì)胞圓形或橢圓形，胞質(zhì)淺藍(lán)紫色，量多，可見空泡，表面常有細(xì)長或粗短的突起。胞核較大，形態(tài)多樣，約占整個(gè)細(xì)胞的1/3～1/2，偏于細(xì)胞的一側(cè)，無核仁，核內(nèi)染色質(zhì)疏松，染成淺紫紅色。胞質(zhì)中可見細(xì)小顆粒及大小不等的空泡（圖1-9、圖1-10）。

巨噬細(xì)胞。細(xì)胞體積大，胞質(zhì)中有很多空泡，核染色質(zhì)著色淺，核邊界不清晰，靠近細(xì)胞邊緣，可見其內(nèi)有吞噬的無核紅細(xì)胞（胞質(zhì)小體）及其他吞噬物。內(nèi)吞噬物較少，形態(tài)及染色與單核細(xì)胞相似（圖1-11、圖1-12）。

血栓細(xì)胞。在血涂片中往往數(shù)個(gè)（3～6）聚集在一起，細(xì)胞呈不規(guī)則橢圓形、棒狀、蝌蚪狀、馬蹄形、淚滴形、紡錘形，核所占比例很大，致密的染色質(zhì)染成深紫紅色甚至暗紫紅色。細(xì)胞質(zhì)邊界不明，淡藍(lán)色或淺紅色，在核外一側(cè)或周圍隱約可見;在棒狀細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)見于細(xì)胞的一端，呈淺紅色;或只在核的外緣有1層淺淡的紅色薄層。核有切跡或凹陷（圖1-13、圖1-14）。

淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞以不規(guī)則圓形居多。細(xì)胞核圓形，中位或稍偏位，多數(shù)核上有清晰可見的缺刻，核所占比例很大，可達(dá)4/5以上，染色較深，暗紫紅色。細(xì)胞質(zhì)被染成較深的藍(lán)色或灰藍(lán)色，顆粒細(xì)膩，但不甚均勻。表面常有偽足狀突起（圖1-16～圖1-18）。

網(wǎng)狀細(xì)胞。細(xì)胞胞體很大，類圓形，不規(guī)則，有很多偽足樣突起。胞核大，橢圓形或類圓形，染色質(zhì)細(xì)沙粒狀。胞質(zhì)淺藍(lán)色，染色不均勻，在形態(tài)特征上類似于哺乳動(dòng)物的造血基質(zhì)細(xì) 胞- 網(wǎng)狀細(xì)胞（圖1-19）。

3 討論

3.1 采血過程

在試驗(yàn)魚生理狀態(tài)穩(wěn)定的情況下采血，確保血液生化指標(biāo)的參數(shù)變化范圍合理。在魚類運(yùn)輸過程中會(huì)產(chǎn)生血液紅細(xì)胞數(shù)量和白細(xì)胞分類百分比的顯著變化[6]，試驗(yàn)魚運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行了1周的馴化飼養(yǎng)，以消除這類應(yīng)激因子的影響。另外不合適的抗凝劑使用可能導(dǎo)致涂片血細(xì)胞嚴(yán)重變形[7]，本研究在前期預(yù)試驗(yàn)中比較研究了不使用抗凝劑與使用肝素鈉抗凝劑或檸檬酸鈉抗凝對(duì)涂片血細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果表明，不使用抗凝劑與使用肝素鈉抗凝劑或檸檬酸鈉抗凝劑對(duì)涂片血細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生的影響不明顯。

3.2 血液指標(biāo)

魚類血液生化指標(biāo)受諸多因素（如年齡、性別、水溫、季節(jié)和營養(yǎng)狀況等）的影響[8-9]，反映了魚體健康狀況及營養(yǎng)水平，可作為水體環(huán)境變化、污染物的監(jiān)測指標(biāo)，也是疾病診斷的重要依據(jù)。本研究結(jié)果表明，斑點(diǎn)叉尾血清中總蛋白濃度、堿性磷酸酶活性、總膽紅素濃度有較大的變化范圍，而血清總蛋白濃度在其他鯉科[10]、鲇形目[11]、鱸形目[12]、鱘科魚類[13]的研究中也存在類似現(xiàn)象。在正常情況下，魚類體內(nèi)有機(jī)成分的分解代謝與合成代謝保持動(dòng)態(tài)平衡，其指標(biāo)值也相對(duì)穩(wěn)定。斑點(diǎn)叉尾膽固醇濃度為5.37 mmol/L，高于白鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙魚（Aristichthys nobilis）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）、 銀鯽（Carassius auratus gibelio）、

鯉魚（Cyprinus carpio）;血清總蛋白濃度為35.16 g/L，與鳙魚相近，低于白鰱、草魚、銀鯽和鯉魚;而白蛋白濃度為 10.92 g/L，與鳙魚和鯉魚相近，高于白鰱，低于草魚和銀鯽[14]，提示魚類血液生化指標(biāo)還因品種差異而不同?？偟膩碚f，魚類血液指標(biāo)值由高到低的順序是肉食性魚類>草食性或雜食性魚類>濾食性魚類。

3.3 血細(xì)胞的形態(tài)

哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞呈雙面凹陷的圓盤狀，沒有細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)沒有細(xì)胞器而有大量血紅蛋白;而大多數(shù)魚類的紅細(xì)胞有細(xì)胞核，紅細(xì)胞中也含有血紅蛋白，因而使胞液呈紅色;血細(xì)胞的種類雖沒有哺乳動(dòng)物的多，但仍具有基本的形態(tài)和功能。

魚類是低等的脊椎動(dòng)物，其幼紅細(xì)胞可以在外周血中成熟，甚至在外周血中直接分裂[15]，直接分裂的紅細(xì)胞在未成熟的歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）外周血中有報(bào)道，但成熟歐洲鰻鱺外周血中沒有[16]。本研究的試驗(yàn)魚為斑點(diǎn)叉尾成魚，其外周血中仍有幼紅細(xì)胞和直接分裂的紅細(xì)胞，試驗(yàn)中觀察到斑點(diǎn)叉尾的紅細(xì)胞形態(tài)比較多樣，與龍華等的報(bào)道[17]相同。

魚類血液的白細(xì)胞種類很多，包括淋巴細(xì)胞、血栓細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。有些魚類具有嗜中、嗜堿和嗜酸粒細(xì)胞[18]，根據(jù)特殊顆粒的結(jié)構(gòu)特征，魚類嗜中性粒細(xì)胞又被分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型等[15-17]。本試驗(yàn)并未觀察到嗜堿性粒細(xì)胞，可能是受染色過程中緩沖液pH值影響，緩沖液pH值為6.4～6.8，嗜堿顆粒易被酸中和，被水溶解，出現(xiàn)脫粒空白區(qū)，即嗜堿性粒細(xì)胞客觀存在但在染色過程中被破壞。此外，本試驗(yàn)未觀察到的嗜中性粒細(xì)胞在許多魚類的嗜中性粒細(xì)胞中都有報(bào)道，如莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）的Ⅰ型粒細(xì)胞、鱖（Siniperca chuatsi）的Ⅱ型粒細(xì)胞[15]、海鱸（Dicentrarchus labras）的嗜異細(xì)胞[19]等。

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