瀕危水生植物水角的離體培養(yǎng)技術(shù)

王景飛　符瑞侃　任軍方　黃賽　呂德任　梁定民　戚華沙

摘要：為建立有效的水角離體培養(yǎng)技術(shù)，以水角的種子和莖段誘導出不定芽，采用單因素方差分析和Duncans 多重比較法比較不同處理間的差異性，研究糖類、pH值、細胞分裂素和生長素對水角生長狀況的影響。結(jié)果表明，以種子為外植體，0.1% HgCl2消毒8 min進而誘導，出現(xiàn)污染率30%，褐化率20%，萌芽率68%，芽點數(shù)5.07個;適宜的增殖培養(yǎng)條件為蔗糖30.00 g/L，pH值為6和6-BA 1.00 mg/L，增殖系數(shù)均為比較組中的最優(yōu)值;NAA 0.20 mg/L 較適合水角生根壯苗，根數(shù)達6.42條，最長根長9.33 cm，株高10.37 cm，莖粗0.31 cm。水角的離體培養(yǎng)技術(shù)探索將有效加快種苗快繁，為瀕危水生植物水角的種質(zhì)保存提供技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水角;離體培養(yǎng);不定芽;增殖系數(shù)

中圖分類號： S682.320.4+3? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0110-04

水角[Hydrocera triflora （L.） Wight. et Arn.]是鳳仙花科水角屬下的一年生水生草本，是單屬單種植物[1]。該植物澤生、直立、草本;葉狹，互生;花左右對稱[2-3]，呈粉紅色。水角生長于海拔100 m的地區(qū)，多生在湖邊、沼澤濕潤地及水稻田中，分布在印度、泰國、印度尼西亞、柬埔寨、越南、斯里蘭卡、馬來西亞、老撾以及我國等地。據(jù)《中國植物志》記載，在我國大陸，水角僅分布于海南（陵水、三亞）[1]。由于環(huán)境變化，水角分布范圍十分狹窄，處于地區(qū)性絕滅狀態(tài)（RE）級別[4-5]。水角具有巨大的科研價值、園藝價值和生態(tài)價值。由于水角現(xiàn)僅有零星分布，處于原始的自生自滅狀態(tài)，因此，深入探索研究水角資源的離體培養(yǎng)技術(shù)，對于水角種質(zhì)保存具有重大意義。

目前關(guān)于水角的研究極少，特別是水角的離體培養(yǎng)技術(shù)尚未見報導。種子繁殖為鳳仙花科花卉資源的主要繁殖方式[6]，但有些鳳仙花僅產(chǎn)生少量的種子或種子活力低，因而采用扦插和組織培養(yǎng)等營養(yǎng)繁殖方式進行繁殖。鳳仙花科的離體培養(yǎng)技術(shù)目前在生產(chǎn)中較少應(yīng)用，佟鳳芹等對鳳仙花莖段培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，鳳仙花莖段可誘導產(chǎn)生大量不定芽，誘導率達100%，在繼代培養(yǎng)過程中，增殖系數(shù)大，適合于種苗快速繁殖[7];王越等采用大旗瓣鳳仙花的莖上側(cè)芽進行組培培養(yǎng)與快速繁殖，增殖系數(shù)在3.50～4.00之間，生根率為100%[8];劉濤等對新幾內(nèi)亞鳳仙離體快速繁殖技術(shù)研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MS+2.00 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA中培養(yǎng)，頂芽萌發(fā)早，生長快，在繼代培養(yǎng)中，增殖系數(shù)達6.00，在誘導生根階段，生根率達100%[9];向太和等開展了鳳仙花離體培養(yǎng)再生植株在試管內(nèi)誘導開花的研究，芽和根誘導分化在MS+3.00 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA培養(yǎng)基中進行，開花誘導的適宜培養(yǎng)基為MS+1.00 mg/L 6-BA+010 mg/L NAA[10]。本研究以水生花卉鳳仙花科水角植物作為試驗材料，研究了水角離體外植體獲得、芽誘導培養(yǎng)、芽增殖培養(yǎng)及生根壯苗培養(yǎng)，旨在建立水角的離體繁殖技術(shù)體系，為其進一步開發(fā)利用及資源保護提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料取自海南省?？谑行缕骆?zhèn)下市村邊路旁水溝里及邊沿濕地，坐標：110°20′40″E，19°47′3.7″N。試驗所需的KT、ZT、TDZ、IBA、IAA、6-BA及NAA均購自上海伯奧生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體取材 采集整株水角樣本連泥帶水裝進水桶里，帶回試驗地點栽培管理，待接種時取用。采集植株上深褐色的成熟種子，裝進采集袋里密封放置在冰箱保鮮層備用。

1.2.2 外植體消毒和芽誘導培養(yǎng) 選擇生長良好的植株，以莖段及種子作為外植體，莖段帶芽長5 cm，種子用紗布包好，均用自來水沖洗干凈，放置于洗潔精溶液中搖蕩3 min，再用自來水沖洗。瀝干水后，在超凈工作臺上，用無菌水沖洗2次，75%乙醇處理15 s，用0.10%HgCl2浸泡、搖晃，分別設(shè)置 5、8、15 min 3種時間處理，無菌水沖洗5次。莖段以莖節(jié)為中心，切取組織1 cm。每袋接1個外植體，每個處理接種15袋，重復3次。芽誘導培養(yǎng)基為1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA（除試驗設(shè)計需要，其余試驗均添加蔗糖3000 g/L，pH值為6），30 d后統(tǒng)計污染率、褐化率及萌芽率和芽點數(shù)。

1.2.3 糖種類對水角增殖培養(yǎng)的影響 以MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA作為培養(yǎng)基，進行 30.00 g/L 的麥芽糖、蔗糖及葡萄糖的糖種類篩選對比試驗。設(shè)置每袋接3個單芽（種子誘導出的芽，下同），每個處理接6袋，重復3次。以增殖系數(shù)為主，側(cè)芽生長狀況、有無愈傷、株高、頂枯數(shù)（頂端枯萎）及根數(shù)為輔助參考評價指標。30 d后記錄每個樣本的相關(guān)數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計。

1.2.4 蔗糖濃度對水角增殖培養(yǎng)的影響 以MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA作為培養(yǎng)基，設(shè)10.00、20.00、30.00、40.00、50.00、80.00 g/L 6個梯度處理。設(shè)置每袋接3個單芽，每個處理接6袋，重復3次。以增殖系數(shù)為主，側(cè)芽生長狀況、有無愈傷、株高、頂枯數(shù)及根數(shù)為輔助參考評價指標。30 d后記錄每個樣本的相關(guān)數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計。

1.2.5 pH值對水角增殖培養(yǎng)的影響 以MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA作為培養(yǎng)基，設(shè)pH值為4、5、6、7、8進行對比試驗。設(shè)置每袋接3個單芽，每個處理接6袋，重復3次。以增殖系數(shù)為主，側(cè)芽生長狀況、有無愈傷、株高、頂枯數(shù)及根數(shù)為輔助參考評價指標。30 d后記錄每個樣本的相關(guān)數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計。

1.2.6 不同細胞分裂素對水角增殖培養(yǎng)的影響 以MS作為基本培養(yǎng)基，對6-BA、KT、ZT及TDZ 4種細胞分裂素進行對比試驗，濃度均為1.00 mg/L。設(shè)置每袋接3個單芽，每個處理接6袋，重復3次。以增殖系數(shù)為主，側(cè)芽生長狀況、有無愈傷、株高、頂枯數(shù)及根數(shù)為輔助參考評價指標。30 d后記錄每個樣本的相關(guān)數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計。

1.2.7 不同6-BA濃度對水角增殖培養(yǎng)的影響 以MS+0.10 mg/L NAA作為培養(yǎng)基，對6-BA濃度進行對比試驗，設(shè)0.20、0.60、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg/L 7個梯度處理。設(shè)置每袋接3個單芽，每個處理接6袋，重復3次。以增殖系數(shù)為主，側(cè)芽生長狀況、有無愈傷、株高、頂枯數(shù)及根數(shù)為輔助參考評價指標。30 d后記錄每個樣本的相關(guān)數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計。

1.2.8 不同的生長素種類對水角生根培養(yǎng)的影響 以MS作為基本培養(yǎng)基，對NAA、IBA和IAA 3種生長素進行對比試驗，濃度均為0.50 mg/L。設(shè)置每袋接3個單芽，每個處理接6袋，重復3次。以根數(shù)、最長根長、株高及莖粗為考核評價指標。30 d后記錄每個樣本的相關(guān)數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計。

1.2.9 不同NAA濃度對水角生根培養(yǎng)的影響 以MS作為基本培養(yǎng)基，對不同NAA濃度進行對比試驗，設(shè)置0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mg/L 6個梯度處理。設(shè)置每袋接3個單芽，每個處理接6袋，重復3次。以根數(shù)、最長根長、株高及莖粗為考核評價指標。30 d后記錄每個樣本的相關(guān)數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計。

統(tǒng)計方法：污染率=污染數(shù)/接種數(shù)×100%;褐化率=褐化數(shù)/接種數(shù)×100%;萌芽率=萌芽數(shù)/接種數(shù)×100%;增殖系數(shù)=不定芽總數(shù)/接種數(shù);根數(shù)=根總數(shù)/接種數(shù);頂枯數(shù)=頂枯總數(shù)/接種數(shù);芽點數(shù)=芽點總數(shù)/接種數(shù)。

數(shù)據(jù)處理使用Excel 2010進行整理、統(tǒng)計和制表;用SPSS 18.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和Duncans多重比較法比較不同處理間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒和芽誘導

由表1可知，0.1%HgCl2（加2滴吐溫）3個時間梯度處理對2種外植體消毒效果不同。以莖段為外植體，5 min處理污染率最高，為100%，其次是8 min處理，污染率為60%，15 min 處理的污染率低至30%，且3個處理間差異顯著;從褐化率來看，5 min處理褐化率最低，為10%，與其他2個處理差異顯著;從萌芽率來看，8 min處理的萌芽率最高，達30%，與其他2個處理差異顯著;從芽點數(shù)來看，8 min處理的芽點數(shù)最高，為4.05個，與5 min處理差異不顯著。綜合比較分析認為，適合水角莖段消毒的時間為8 min。

以種子為外植體，綜合4個考核指標，最佳的處理時間為8 min，污染率30%，褐化率20%，萌芽率68%，芽點數(shù)為5.07個。方差分析結(jié)果表明，8 min與15 min處理間的污染率差異不顯著;從褐化率及萌芽率來看，8 min處理與5 min處理的褐化率差異不顯著，與15 min處理差異顯著，8 min處理的萌芽率與其他2個處理差異顯著;從芽點數(shù)來看，各處理的芽點數(shù)數(shù)量次序表現(xiàn)為8 min>5 min>15 min，三者間差異不顯著（表2）。

綜合考慮分析，在消毒時間上，莖段和種子均8 min消毒效果最好;在外植體選擇上，種子易萌芽且長勢好，較適合作為外植體進行消毒誘導。

2.2 不同糖種類對水角增殖的影響

從表3看出，不同糖種類對水角增殖的影響效果不同。麥芽糖處理的增殖系數(shù)為4.80，無愈傷，莖頂黃化較嚴重，平均每株頂枯數(shù)0.83條，且出現(xiàn)較多的根系，平均每株有1.70條，平均株高為5.47 cm;葡萄糖處理的增殖系數(shù)為5.90，有愈傷，莖頂黃化較嚴重，平均每株頂枯數(shù)0.77條，平均根數(shù)達0.90條，平均株高為4.75 cm;蔗糖處理的增殖系數(shù)為6.13，無愈傷，莖頂黃化少，平均每株頂枯數(shù)0.40條，平均根數(shù)達0.90條，平均株高為6.00 cm。由方差分析結(jié)果可知，蔗糖與葡萄糖處理的增殖系數(shù)差異不顯著，考慮到蔗糖的價格實惠，且培養(yǎng)出來的莖節(jié)多，莖頂黃化少，無愈傷形成，因此，蔗糖為水角增殖適宜培養(yǎng)的糖種類。

2.3 不同蔗糖濃度對水角增殖的影響

從表4看出，不同蔗糖濃度對水角增殖的影響呈現(xiàn)相關(guān)性。10.00～30.00 g/L蔗糖濃度范圍內(nèi)，隨著蔗糖濃度升高，水角不定芽增殖系數(shù)逐漸增加，且顏色逐漸加深，長勢漸好，可見在一定范圍內(nèi)，30.00 g/L蔗糖對水角不定芽增殖有明顯的促進作用;30.00～80.00 g/L蔗糖濃度范圍內(nèi)，隨著蔗糖濃度升高，水角不定芽增殖系數(shù)逐漸降低，說明較高和較低濃度蔗糖不利于水角的增殖培養(yǎng)。方差分析的結(jié)果表明，20.00～50.00 g/L蔗糖濃度范圍內(nèi)，4個處理間增殖系數(shù)差異不顯著。30.00 g/L蔗糖處理出現(xiàn)莖段節(jié)點多，葉綠，生長勢好，因此，水角增殖最佳蔗糖濃度為 30.00 g/L。

2.4 不同pH值對水角增殖的影響

從表5可知，不同pH值對水角增殖的影響效果不同。增殖系數(shù)介于2.73～6.25之間，pH值為6處理的增殖系數(shù)最高，達6.25。除pH值為4處理，其他4個處理的增殖系數(shù)差異不顯著，增殖系數(shù)介于4.10～6.25之間;pH值為6處理水角芽粗，葉綠，莖長，頂枯多，根多，因此，適宜水角培養(yǎng)的pH值為6。

2.5 不同細胞分裂素對水角增殖的影響

從表6可看出，不同細胞分裂素對水角增殖有不同的影響。6-BA處理不定芽增殖系數(shù)達5.40，無愈傷，不定芽狀況好，芽粗，頂枯數(shù)較少，莖節(jié)長，平均株高達3.62 cm，根較少，平均每株的根數(shù)為0.71條;KT處理不定芽增殖系數(shù)為3.44，不定芽狀況適中，芽細，淡黃，莖徒長，平均株高為 4.17 cm，根多，平均每株的根數(shù)為1.22條;ZT處理不定芽增殖系數(shù)為3.47，不定芽狀況偏差，芽細，微黃，平均株高為 3.58 cm，基部發(fā)根多，平均每株的根數(shù)為1.19條;TDZ處理不定芽增殖系數(shù)為5.24，不定芽狀況良好，有愈傷，芽細，色偏黃，莖較短，平均株高為1.48 cm，發(fā)根相對較少，平均每株的根數(shù)為0.09條。方差分析結(jié)果顯示，6-BA處理不定芽增殖系數(shù)與TDZ處理間的差異不顯著，與KT處理及ZT處理間的差異達到顯著水平。綜合比較分析認為，選用6-BA作為增殖激素時，水角的增殖系數(shù)最高，芽的生長勢好，芽粗壯，無愈傷，節(jié)點多，因此，6-BA較適宜做為水角增殖的細胞分裂素。

2.6 不同6-BA濃度對水角增殖的影響

由表7可知，不同6-BA濃度對水角不定芽的增殖影響極大?？瞻讓Ρ忍幚聿欢ㄑ吭鲋诚禂?shù)為4.73，沒有形成側(cè)芽，叢生狀，莖直立徒長，平均株高達9.15 cm;6-BA 0.20 mg/L處理的增殖系數(shù)6.03，少有側(cè)芽形成，莖徒長，平均株高為10.30 cm，根少，平均每株的根數(shù)為3.00條;6-BA 0.60 mg/L 處理的增殖系數(shù)6.23，不定芽狀況偏差，平均株高為8.15 cm，基部長根多，平均每株的根數(shù)為2.50條;6-BA 1.00 mg/L處理不定芽增殖系數(shù)最高，達8.00，不定芽狀況好，芽粗，綠色，平均株高為6.30 cm，長根相對較少，平均每株的根數(shù)為0.90條，與其他7個處理間的不定芽增殖系數(shù)差異不顯著;6-BA 1.50 mg/L處理不定芽增殖系數(shù)為7.20，不定芽狀況中等，芽偏細，平均株高為5.55 cm，平均每株的根數(shù)為0.80條;6-BA 2.00 mg/L處理不定芽增殖系數(shù)5.50，不定芽狀況中等，芽細，平均株高為5.10 cm，根少，平均每株的根數(shù)為0.60條;6-BA 2.50 mg/L處理不定芽增殖系數(shù)為5.22，不定芽狀況中等，芽偏細，平均株高為4.05 cm，平均每株的根數(shù)為0.37條;6-BA 3.00 mg/L處理不定芽增殖系數(shù)為4.80，不定芽狀況中等，芽細，平均株高為4.64 cm，根少，平均每株的根數(shù)為0.30條。

綜合分析顯示，當6-BA濃度為1.00 mg/L時，水角不定芽增殖系數(shù)最高;6-BA 0～1.00 mg/L處理，增殖系數(shù)呈上升趨勢，6-BA 1.00～3.00 mg/L處理，增殖系數(shù)呈下降趨勢;在培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，植株根數(shù)與濃度呈反相關(guān)性。所以，6-BA 1.00 mg/L為適宜的6-BA處理水角增殖的濃度。

2.7 不同生長素對水角生根的影響

由表8可知，不同生長素種類對水角的生根效果不同。3種生長素種類處理間的根數(shù)差異達到顯著性水平，分別為6.22、4.70、5.48條。從最長根長來看，3個處理的最長根長介于2.84～7.99 cm，其中NAA處理的最長根最長，達 7.99 cm，與其他2個處理間差異顯著。從株高來看，各處理株高在2.06 cm及以上，其中NAA處理的株高最高，為 6.23 cm。從莖粗來看，NAA處理的莖較粗壯，生長勢為 NAA>IAA>IBA。綜合比較分析認為，適合水角根系發(fā)育的生長素種類為NAA。

2.8 不同NAA濃度對水角生根的影響

由表9可知，不同NAA濃度對水角的生根效果差異較大。0.20～0.80 mg/L NAA 4種處理間的根數(shù)差異不顯著，分別為6.42、6.40、6.36、6.07條，與1.00、1.20 mg/L NAA處理差異顯著，1.00 mg/L NAA處理的根數(shù)最少，為3.59條。從最長根長來看，6個處理的最長根長介于4.44～9.33 cm，其中0.20 mg/L NAA處理的最長根最長，達9.33 cm，與其他5個處理間差異顯著，高濃度NAA處理的最長根長表現(xiàn)出抑制效果，低至4.44 cm。從株高來看，各處理株高在5.08 cm及以上，其中0.20 mg/L NAA處理的株高最高，為10.37 cm。從莖粗來看，NAA處理的莖粗隨著濃度的升高，表現(xiàn)出反相關(guān)性。綜合比較分析認為，適合水角根系發(fā)育的NAA濃度為0.20 mg/L。

3 結(jié)論

本研究對水角進行了外植體的離體培養(yǎng)研究。結(jié)果表明，莖段和種子均在0.10% HgCl2下消毒8 min效果最優(yōu)，莖段消毒和芽誘導的效果分別為污染率60%，褐化率50%，萌芽率30%，一個外植體的平均芽點數(shù)為4.05個;種子消毒和芽誘導的效果分別為污染率30%，褐化率20%，萌芽率68%，一個外植體的平均芽點數(shù)5.07個;綜合考慮分析，在外植體選擇上，種子數(shù)量多，易消毒，且萌芽率高，長勢好，因此，種子較適合作為外植體進行消毒和誘導。在增殖方面，適宜的增殖培養(yǎng)條件為蔗糖濃度為 30.00 g/L，pH值為6和6-BA 1.00 mg/L，增殖系數(shù)均為比較組中的最優(yōu)值，其中以 MS+0.10 mg/L NAA作為培養(yǎng)基，添加1.00 mg/L 6-BA，增殖系數(shù)達8.00。在生根方面，進行了NAA、IBA和IAA 3種生長素種類處理的對比，結(jié)果表明，適合水角根系發(fā)育的生長素種類為NAA;在NAA不同濃度的篩選中，以0.20 mg/L為最佳激素濃度選擇，根數(shù)達到6.42條，最長根長為9.33 cm，株高為10.37 cm，莖粗為 0.31 cm，能夠達到生根壯苗的效果。

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