植物源抑菌劑荊芥的抑菌機(jī)制研究

王端好

摘要：測(cè)定荊芥及其提取物對(duì)從酒曲中分離出的酵母菌和霉菌的抑菌效果，研究荊芥的抑菌機(jī)制。結(jié)果表明，荊芥原液及其提取物溶液對(duì)酵母菌和霉菌均有抑菌活性。荊芥處理后菌懸液的電導(dǎo)率和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度都有不同程度的提高，荊芥中的有效成分破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，增大細(xì)胞膜的通透性或者使其破裂，從而使細(xì)胞內(nèi)容物外泄，起到抑菌作用。

關(guān)鍵詞：荊芥;霉菌;酵母菌;通透性;抑菌機(jī)制

中圖分類號(hào)： TS201.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）03-0098-02

荊芥，別稱香荊薺、假蘇，是唇形科、荊芥屬多年生植物[1]。莖堅(jiān)，基部木質(zhì)化，多分枝，葉黃綠色，穗稍黑紫黃綠色。味平，性溫，無毒，清香氣濃。荊芥中含有醇、酮、酯、萜烯、萜烷類化合物、有機(jī)酸、谷甾醇、脫氫樅油烯、3-亞胺基-N-氮代乙酰胺基丁內(nèi)酰胺、苯駢呋喃類化合物等[2-4]。荊芥的葉和花穗可入藥，荊芥有解熱鎮(zhèn)痛的作用，主要用來治療感冒發(fā)熱、頭痛、咳嗽等疾病。有研究表明，荊芥具有抗炎、抗病原微生物、抗氧化等作用[5-9]。據(jù)資料報(bào)道，用從荊芥中提取的揮發(fā)油做抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明荊芥揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、黃曲霉、綠色木霉等均具有一定的抑制作用[10-13]。由植物產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)多種多樣，是研制和生產(chǎn)無毒（或低毒）、無殘留、高效、低成本抑菌藥劑的理想原料。因此，進(jìn)行植物有效成分抑菌作用以及機(jī)制的研究，是開發(fā)新型治療人類疾病的藥物、新型植物農(nóng)藥以及新型食品防腐劑的理論基礎(chǔ)。荊芥具有良好的抑菌作用，但是其抑菌活性物質(zhì)以及抑菌機(jī)制尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)對(duì)荊芥的抑菌活性以及作用機(jī)制進(jìn)行研究，以期能將荊芥用作生產(chǎn)酒曲的植物源抑菌劑和賦香劑或作為防腐劑等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

試驗(yàn)用的霉菌和酵母菌均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室從酒曲中分離篩選得到。荊芥和荊芥提取物粉末均為網(wǎng)上購(gòu)買。牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、95%乙醇、85%磷酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。PDA培養(yǎng)基：蒸煮200 g馬鈴薯用濾布過濾后得到 1 000 mL 濾液，20 g葡萄糖，20 g瓊脂;LB培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl、1 000 mL水，pH值調(diào)至7，再加20 g瓊脂[14]。

1.2 主要儀器及設(shè)備

手提式蒸汽滅菌鍋，購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HNY-211B全溫培養(yǎng)振蕩器，購(gòu)自天津市歐諾儀器儀表有限公司;SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)，購(gòu)自上海喬躍電子有限公司;SPX-250B5H-11生化培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司;BMM-50電子顯微鏡，購(gòu)自上海比目?jī)x器有限公司;UV-2501PC紫外-可見分光光度計(jì)，購(gòu)自日本島津儀器公司;DDS-11A電導(dǎo)率儀，購(gòu)自上海雷韻實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 荊芥原液的配制 將荊芥用水洗滌干凈后，置烘箱內(nèi)烘干，然后用研缽研成粉末。精確稱取50 g荊芥粉末置于適量蒸餾水中，蒸煮30 min后用3層紗布過濾，棄去濾渣定容至1 000 mL，即得2%荊芥原液。

1.3.2 抑菌試驗(yàn) 將2%荊芥原液以及2%荊芥提取物溶液分別加入接種霉菌和酵母菌后的液體培養(yǎng)基中至荊芥不同的濃度（0.02%、0.20%、0.40%、1.00%、2.00%），在28 ℃，150 r/min 的條件下培養(yǎng)15 h，用顯微鏡計(jì)數(shù)。

在配制PDA固態(tài)平板培養(yǎng)基時(shí)加入2%荊芥原液以及2%荊芥提取物溶液至荊芥不同的濃度（0.02%、0.20%、0.40%、100%、2.00%），用移液槍取出0.1 mL菌液涂布于滅菌后的固態(tài)平板培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在30 ℃的條件下培養(yǎng)48 h，計(jì)算菌落數(shù)。

1.3.3 菌懸液電導(dǎo)率的測(cè)定 將酵母菌及霉菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取適量菌液，分別加入適量的2%荊芥原液以及2%荊芥提取物溶液，并以蒸餾水作為對(duì)照，每隔30 min測(cè)量1次培養(yǎng)液的電導(dǎo)率[15]。

1.3.4 菌懸液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測(cè)定 菌懸液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 荊芥的抑菌效果

通過在顯微鏡下觀察液體培養(yǎng)基中2種菌體的濃度以及肉眼觀察固態(tài)培養(yǎng)基菌落數(shù)，由表1可知，荊芥原液和荊芥提取物溶液對(duì)酵母菌和霉菌均有抑制作用，荊芥原液隨著濃度的增加，對(duì)酵母菌的抑制作用減弱，對(duì)霉菌的抑制作用增強(qiáng);荊芥提取物溶液隨著濃度的增加，對(duì)酵母菌的抑制作用增強(qiáng)，而對(duì)霉菌的抑制作用減弱;相同濃度的荊芥原液和荊芥提取物溶液對(duì)2種菌的抑制作用不同。0.20%的荊芥原液和荊芥提取物溶液對(duì)酵母菌和霉菌均具有較強(qiáng)的抑制作用。

2.2 荊芥對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響

當(dāng)微生物處于不利環(huán)境或受到藥物毒害時(shí)，往往會(huì)導(dǎo)致其生物膜流動(dòng)性降低和半透性喪失，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)鉀離子等電解質(zhì)大量外泄，培養(yǎng)液電導(dǎo)率的改變可以反映細(xì)胞膜滲透性的變化，這些離子的丟失導(dǎo)致多種代謝途徑受阻，同時(shí)影響多種酶的活性以及膜的穩(wěn)定性;另一方面膜流動(dòng)性降低也影響細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的調(diào)節(jié)，使細(xì)胞吸脹受損甚至死亡[17]。由 圖1、圖2可知，加入2%荊芥原液時(shí)，菌懸液的電導(dǎo)率均高于對(duì)照組，可能是由于荊芥中的部分成分所帶的電荷導(dǎo)致菌懸液的電導(dǎo)率上升，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，加了2%荊芥原液和2%荊芥提取物溶液的電導(dǎo)率均逐漸增大。因此推斷荊芥中的有效成分破壞了酵母菌和霉菌細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞膜的通透性增加，電解質(zhì)外泄而導(dǎo)致電導(dǎo)率升高。細(xì)胞膜是細(xì)胞的保護(hù)屏障，當(dāng)其造成破壞時(shí)，會(huì)打破細(xì)胞的保護(hù)屏障，使其內(nèi)部的電解質(zhì)外泄到培養(yǎng)液中，從而使培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升，使細(xì)胞吸脹受損甚至死亡。

2.3 荊芥對(duì)胞外蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

由圖3、圖4可知，經(jīng)2%荊芥原液和2%荊芥提取物溶液處理后，霉菌和酵母菌的菌懸液胞外蛋白的質(zhì)量濃度均增加。蛋白質(zhì)分子相對(duì)較大，當(dāng)細(xì)胞膜破損到一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)就會(huì)外泄，導(dǎo)致溶液的蛋白質(zhì)濃度增大。可以推斷荊芥的一些有效成分使酵母和霉菌的細(xì)胞膜嚴(yán)重破損甚至破裂，造成細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)的外泄從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量的提高。細(xì)胞膜破損后，細(xì)胞內(nèi)容物外滲，細(xì)胞吸脹受損甚至死亡。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了荊芥原液以及荊芥提取物溶液對(duì)酵母菌和霉菌2種菌的抑制活性，并對(duì)其抑菌機(jī)制進(jìn)行探討，得出了以下結(jié)論：（1）荊芥原液以及荊芥提取物溶液對(duì)酵母菌和霉菌均有一定程度的抑制作用;（2）不同濃度的荊芥原液及荊芥提取物溶液對(duì)2種菌的抑菌情況有明顯差異;（3）荊芥原液及荊芥提取物溶液通過破壞細(xì)胞膜、增大菌體細(xì)胞膜的通透性以及完整性從而使細(xì)胞內(nèi)容物外滲，細(xì)胞吸脹受損甚至死亡，達(dá)到抑菌目的。

參考文獻(xiàn)：

[1]杜成智，覃潔萍，陳玉萍，等. 不同產(chǎn)地荊芥揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（1）：188-190.

[2]張 麗，馮有龍，丁安偉. 荊芥化學(xué)成分的研究[J]. 中藥材，2001，24（3）：183-184.

[3]張?jiān)?，?峻，石任兵，等. 荊芥化學(xué)成分的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2006，31（13）：1118-1119.

[4]胡丹丹，黃 山，李 斌，等. 藏荊芥與荊芥的揮發(fā)性成分比較[J]. 中成藥，2016，38（5）：1078-1082.

[5]臧林泉，胡 楓，韋 敏，等. 荊芥揮發(fā)油抗腫瘤作用的研究[J]. 廣西中醫(yī)藥，2006，29（4）：60-62.

[6]蘭海梅，陳寶田，楊 柳. 荊芥連翹湯浸泡治療小腿慢性潰瘍臨床觀察[J]. 四川中醫(yī)，2006，24（9）：80-82.

[7]趙 蓉，陳大蓉. 中西醫(yī)結(jié)合治療成人水痘臨床觀察[J]. 實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2008，24（1）：36.

[8]何 婷，陳 恬，曾 南，等. 荊芥揮發(fā)油體外抗甲型流感病毒作用及機(jī)制的研究[J]. 中藥藥理與臨床，2012，28（3）：51-55.

[9]湯 奇，楊發(fā)龍，曾 南，等. 荊芥揮發(fā)油及其主要成分抗流感病毒作用研究[J]. 中藥藥理與臨床，2012，28（2）：29-32.

[10]Kumar R，Mishra A K，Dube N K，et al. Evaluation of Chenopodium ambrosioides oil as a potential source of antifungal，antiaflatoxigenic and antioxident activity[J]. International Joural of Food Microbiology，2007，115（2）：159-164.

[11]Jardim C M，Jham G N，Dhingra O D，et al. Composition and antifungal activity of the essential oil of the Brazilian Chenopodium ambrosioides L.[J]. Journal of Chemical Ecology，2008，34（9）：1213-1218.

[12]聶小妮，梁宗鎖，段琦梅，等. 土荊芥揮發(fā)油的化學(xué)成分及抗菌活性研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，38（11）：151-155.

[13]李 元，廖 穎，嚴(yán) 偉，等. 四川土荊芥精油對(duì)植物病原真菌的抗菌活性[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2010，19（5）：1176-1181.

[14]楊汝德. 現(xiàn)代工業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2009：250-259.

[15]陳國(guó)妮，孫飛龍，閆亞茹，等. 馬齒莧黃酮類化合物抑菌機(jī)理研究[J]. 化學(xué)與生物工程，2015，32（10）：34-37.

[16]楊海清. 桃褐腐病菌致病性及拮抗細(xì)菌生防機(jī)制的研究[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[17]馬迪根M T，馬丁克J M. 微生物生物學(xué)[M]. 李明春，楊文博，譯. 11版.北京：科學(xué)出版社，2009.范如芹，張振華，羅 佳. 高吸水樹脂對(duì)栽培基質(zhì)保肥性能及辣椒養(yǎng)分吸收的影響研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（3）：107-109.