農(nóng)桿菌介導的水稻快速高效基因轉化系統(tǒng)

高璐　薛永來

摘要：農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉化體系被廣泛應用于水稻功能基因研究、T-DNA插入突變體庫創(chuàng)建和農(nóng)藝性狀改良等研究領域。然而水稻轉基因操作需要超過3個月的組織培養(yǎng)時間。運用組織培養(yǎng)和農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化技術，對水稻遺傳轉化體系進行快速高效的優(yōu)化。結果表明，成熟種子用2，4-D誘導愈傷7 d后，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉化效率最佳;抗性篩選時間以2～4周為最佳。根據(jù)以上優(yōu)化條件，從成熟種子誘導愈傷至獲得轉基因株系的時間被縮短到6周左右。將有效降低水稻長時間組培導致的體細胞無性系變異概率，對促進水稻分子育種的發(fā)展有重要意義。

關鍵詞：粳稻;農(nóng)桿菌介導;遺傳轉化

中圖分類號： S511.2+20.1? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0039-03

水稻高效遺傳轉化體系的建立是進行水稻功能基因分析、創(chuàng)建T-DNA插入突變體庫和分子遺傳改良的技術基礎。然而一般來講，在獲得水稻轉基因株系前，至少需要3個月以上的組織培養(yǎng)時間，這使得水稻的分子生物學相關研究周期遠比其他物種漫長。另有文獻報道，長時間的體外組織培養(yǎng)可能引起水稻愈傷組織的無性系變異，導致基因組改變[1]。因此建立高效快速的轉化體系，不僅能夠提高操作效率，還可以盡可能地減少細胞無性系變異，對水稻基因工程研究有重要意義[2-6]。

研究認為，水稻成熟種子誘導愈傷培養(yǎng)至少2～3周后，獲得的愈傷組織才適用于農(nóng)桿菌侵染[1，7-8]。但是Toki等曾報道農(nóng)桿菌介導的高速的水稻轉基因體系，認為在水稻愈傷培養(yǎng)1 d后即可進行侵染共培養(yǎng)試驗[9]。但也有研究認為早期侵染并不能獲得足夠的陽性抗性愈傷，轉化率低于10%[10]。本研究就水稻遺傳轉化體系中預培養(yǎng)以及抗性篩選階段的條件進行摸索，在保證高效農(nóng)桿菌轉化率的同時，建立既高效又高速的水稻遺傳轉化體系。

1 材料與方法

試驗于2015年12月至2016年10月在江蘇大學環(huán)境與安全工程學院生物質能源研究所能源植物研究室進行。使用的水稻（Oryza sativa）品種為日本晴和南粳9108。

1.1 質粒構建

本研究使用的表達載體pBINPLUS為筆者所在實驗室保存，在AscⅠ和PacⅠ酶切位點之間插入RbcS1啟動子和終止子序列，構建成pBINR載體，將該載體使用凍融法導入農(nóng)桿菌植株EHA105中[11]。

1.2 培養(yǎng)基

本試驗所使用各種培養(yǎng)基均列于表1中。

1.3 植物材料與預培養(yǎng)

試驗使用粳稻品種日本晴和南粳9108由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院提供，其中南粳9108為江蘇省內及周邊地區(qū)廣泛種植的推廣品種。水稻種子剝去穎殼加1滴含吐溫-20的5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒15 min，然后用無菌水清洗5遍。然后再用無吐溫的次氯酸鈉溶液消毒15 min，并用無菌水沖洗10遍左右，徹底去除次氯酸鈉殘留。用無菌濾紙吸干種子表面水分后，種子胚向上斜插到NBD培養(yǎng)基上，16 h光照/8 h黑暗，28 ℃培養(yǎng)。每皿放置20粒種子，每個處理設6個重復。

1.4 農(nóng)桿菌侵染及轉基因植物篩選

挑取含有pBINR載體的農(nóng)桿菌單菌落于含有50 mg/L卡那霉素的AAM液體培養(yǎng)基中，28 ℃遮光200 r/min振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.4～0.6，離心收集菌體并用液體NB-As重懸至D600nm=0.1。選取大小合適、狀態(tài)良好的的愈傷組織，浸入農(nóng)桿菌重懸液中30 min，在無菌濾紙上吸干多余菌液后，將愈傷組織轉移到鋪有1層無菌濾紙的固體NBD-As培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3 d。將愈傷用無菌水清洗3遍，之后用含有 150 mg/L Timentin的無菌水浸泡10 min，將愈傷多余水分吸干，轉移至NBD-As培養(yǎng)基恢復培養(yǎng)4 d。之后轉移到含有篩選抗生素卡那霉素的NBD-TK培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選培養(yǎng)，每2周繼代1次。有卡那霉素抗性的愈傷組織轉移入分化培養(yǎng)基RE1中，催化的不定芽生長至3～5 cm小苗時，將小苗切割并轉入生根培養(yǎng)基RE2中進行生根誘導，獲得T0代幼苗。

1.5 轉基因植物的分子鑒定

取T0代幼苗葉片0.1 g，采用TaKaRa植物基因組DNA小量純化試劑盒（No. 9768）提取水稻總DNA。根據(jù)RbcS1啟動子和終止子序列避開水稻同源序列，設計合成引物，序列為P1：5′-TTTAGGAGATACCAGCCAGG-3′;P2：5′-AACTTAGTAGCCATCGGGC-3′，PCR退火溫度為55 ℃，循環(huán)次數(shù)為30次。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在 800 bp 左右有目的條帶即為陽性。

2 結果與分析

2.1 預培養(yǎng)條件對水稻愈傷培養(yǎng)的影響

水稻胚誘導愈傷組織受到多方面因素的影響。本試驗發(fā)現(xiàn)種子的狀態(tài)和光照對水稻愈傷的生長有明顯影響。優(yōu)良的種子狀態(tài)是愈傷生成的關鍵因素（表2）。在剝除穎殼的過程中根據(jù)形態(tài)等因素對種子進行初步篩選，對后期水稻愈傷組織的成功誘導有很重要的作用。另外，對比暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)的水稻愈傷發(fā)現(xiàn)，光照培養(yǎng)下的愈傷組織生長更快，呈淺黃色且較致密，更有利于縮短培養(yǎng)時間和分化誘導。

2.2 預培養(yǎng)時間對農(nóng)桿菌侵染轉化效率的影響

預培養(yǎng)時間對日本晴和南粳9108這2個品種的轉化率有明顯的影響。經(jīng)過2～3次繼代的愈傷轉化效率最高，明顯高于培養(yǎng)4周未繼代直接侵染的愈傷組織。繼代超過4次的2個品種的轉化率均開始明顯下降，同時分化能力也明顯下降。說明長時間的誘導愈傷培養(yǎng)對水稻基因轉化率和分化率都有影響。研究發(fā)現(xiàn)2個品種預培養(yǎng)4 d和7 d后直接進行農(nóng)桿菌侵染，也能獲得較高的轉化率，其中預培養(yǎng)7 d后的基因轉化率高達69.0%和61.7%，接近繼代2～3次后水稻愈傷組織的轉化效率（表3）。

2.3 篩選時間對分化效率的影響

水稻愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，被轉入含有篩選抗生素的篩選培養(yǎng)基上，以篩選出成功將目的基因整合入植物基因組的陽性克隆。為提高農(nóng)桿菌侵染效率，將農(nóng)桿菌菌體收集并用 NB-As 培養(yǎng)基重新懸浮菌體至 D600 nm為0.1。 試驗證明，較低的農(nóng)桿菌密度不但能夠提高轉化效率（數(shù)據(jù)未顯示），并且容易洗清，避免因農(nóng)桿菌生長旺盛無法徹底去除而將愈傷組織包埋、影響愈傷組織生長的現(xiàn)象。

篩選培養(yǎng)的時間對愈傷組織分化效率也有影響。篩選時間太短，假陽性克隆太多，加大了后期分子生物學鑒定的工作量;篩選時間太長，不但拖延科研時間，還會出現(xiàn)因愈傷組織培養(yǎng)時間太長而導致分化能力下降的現(xiàn)象。如表4所示，篩選培養(yǎng)繼代2次以內，水稻愈傷組織的分化效率在80%左右，隨著繼代次數(shù)的增加，分化效率有降低的趨勢，且延長是整個體系的操作時間。

2.4 轉基因水稻幼苗的PCR驗證

將生根后的不定芽幼苗從培養(yǎng)基中取出，移栽到含有營養(yǎng)土的水桶中，在溫室中栽培，即可繼續(xù)生長直至收獲。為進一步鑒定陽性植株中目的基因的存在，對T0代幼苗的葉片進行PCR鑒定。結果如圖1所示，2個水稻品種的轉化率沒有差異，說明本體系對該2個品種均適用。同時篩選培養(yǎng)時間對水稻的植株轉化率也沒有明顯影響（數(shù)據(jù)未顯示）。

3 討論與結論

水稻是我國重要的糧食作物，也是農(nóng)業(yè)科學和植物學研究的重要模式植物。建立高效的水稻轉化體系，是水稻功能基因研究、性狀改良、抗性提高等科學研究的技術基礎。自1994年Hiei等報道水稻轉基因技術以來，國內外的科研工作者通過培養(yǎng)基改良、操作步驟優(yōu)化等措施，不斷改進優(yōu)化水稻的基因轉化體系，實現(xiàn)了水稻轉化率的大幅提高[7，9-10，12-16]。近年來，無選擇標記技術更是廣泛應用于水稻新品系的培育[17-19]。試驗材料是水稻農(nóng)桿菌轉化的重要基礎。本研究采用成熟種子為試驗材料，材料簡單易得，經(jīng)過初步的篩選，愈傷誘導率可以高達90%以上，預培養(yǎng)7 d作為轉化的受體材料，轉化率可達60%～70%，完全滿足研究需要。本系統(tǒng)使用較高濃度的次氯酸鈉和吐溫-20對水稻種子進行2次消毒。該方法簡單易行，在實際操作中污染率基本為零，而且同時還去除了種子表面各種油和蠟質，有利于農(nóng)桿菌的順利侵染[9]。光照在水稻種子萌發(fā)和愈傷生成中也有重要的作用，與暗培養(yǎng)相比較，長日照條件下培養(yǎng)的愈傷組織生長更快、結構更加緊密，這種愈傷有利于后期芽的分化[10，14，20-22]。

本研究主要針對水稻轉基因體系中耗時較長的2個步驟（即愈傷組織預培養(yǎng)和抗性篩選過程）進行優(yōu)化。過去的大量研究中，水稻在含有2，4-D的培養(yǎng)基上培養(yǎng)28 d以上，誘導出足夠的愈傷組織用來轉基因操作。Toki等曾報道，愈傷誘導1～5 d后用農(nóng)桿菌侵染即可獲得較高的轉化率[9]。但是筆者多次試驗并沒有達到文獻報道的高轉化率。結合前期經(jīng)驗，對水稻轉基因部分步驟進行摸索優(yōu)化，最終發(fā)現(xiàn)，在含有2，4-D的培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，能獲得可接受的高轉化率，且結果穩(wěn)定。同時較低濃度的農(nóng)桿菌不僅能夠獲得更高的轉化率，還避免了后期因農(nóng)桿菌濃度過高引起的愈傷感染過度或農(nóng)桿菌污染引起的愈傷褐化死亡[13，15，22]。在抗性篩選階段，研究發(fā)現(xiàn)2周以上的抗性篩選過程即可有效地去除未整合目的基因的陰性愈傷，同時獲得高效分化的陽性愈傷組織。以上結果與文獻報道結果[13，15，20-23]相似，且得到后期分子生物學手段驗證。通過以上2個步驟的優(yōu)化，將水稻轉基因操作體系縮短到6周以內，提高了工作效率，對于水稻的功能基因研究乃至分子遺傳育種都有重要意義。

在農(nóng)作物生理生化和分子遺傳育種研究工作中，水稻轉基因體系已經(jīng)是必不可少的技術平臺之一。本研究通過優(yōu)化預培養(yǎng)和抗性篩選2個步驟，縮短了水稻轉基因的操作周期，為提高科研效率提供了可能。同時，根據(jù)該項研究的結果，可對其他水稻品種以及禾本科其他植物的轉化進行優(yōu)化研究。本體系的擴大應用將有助于利用分子生物學手段對禾本科植物的功能基因組和農(nóng)藝價值改良的深入研究。

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