八寶景天莖段的組織培養(yǎng)和快速繁殖①

羅 丹， 楊少成， 宗燦華， 孫雪芳， 孫曉薇， 宗憲春*

(1.牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

0 引 言

八寶景天(Sedumspectabileboreau)又名華麗景天、大葉景天、蝎子草，為景天科景天屬多年生肉質(zhì)草本植物[1,2]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)前景。主要分布在我國(guó)的云南、貴州、四川、湖北、東北等地[3]，可用作地被，也可用在花境和巖石園中[4]。八寶景天在園林園藝方面被廣泛應(yīng)用，越來(lái)越受到人們的重視，其傳統(tǒng)的繁殖技術(shù)主要是以分株、播種和扦插為主[6]，不能滿足生產(chǎn)上的需要。目前關(guān)于八寶景天組培方面的報(bào)道較少[7～9]，有關(guān)其莖段組織培養(yǎng)的研究未見報(bào)道。文中以八寶景天的莖段為外植體，探究其組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，為八寶景天種質(zhì)資源的保存及快速繁殖提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

八寶景天。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行最適消毒時(shí)間篩選

剪取八寶景天幼嫩的莖段，流水沖洗30min，75%的酒精處理30s后，置于0.1%的升汞中消毒，時(shí)間分別設(shè)定2、4、6、8 min，然后用無(wú)菌水沖洗4-5次，切掉兩端的褐化傷口，進(jìn)行培養(yǎng)觀察。

1.2.2 不定芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基篩選

將無(wú)菌帶芽莖段接種到附加不同濃度6-BA(1.0、2.0和3.0mg/L)、NAA(0.1、0.2和0.3mg/L)的MS基本培養(yǎng)基中，對(duì)其進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。每個(gè)培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接3個(gè)莖段，重復(fù)3次，20 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率。

將叢生芽分割后進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每個(gè)增殖培養(yǎng)基中移入3個(gè)芽。每30 d繼代1次。繼代過(guò)程中觀察芽的增殖情況，并篩選出芽增殖的最適培養(yǎng)基。

1.2.3 生根培養(yǎng)基的篩選

當(dāng)不定芽高2-3 cm時(shí)，將其接至附加不同濃度的NAA(0、0.1、0.2、0.3 mg/ L)、IBA(0、0.1、0.2、0.3 mg/ L)的1/2 MS基本培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。20 d后分別統(tǒng)計(jì)生根率及苗生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)基pH值均為5.8，瓊脂6g/L，蔗糖30g/L，在1.2kg/cm2壓力下滅菌20min.接種后置于22-24℃培養(yǎng),光照強(qiáng)度為2000lx, 每天光照時(shí)間為12h。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)八寶景天莖段消毒效果的影響

外植體滅菌成功與否直接影響植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行[10]。由表1可以看出：隨著消毒時(shí)間的增加，外植體的污染率逐漸降低，死亡率逐漸上升。存活率在4 min時(shí)存活率為88.7%，6 min時(shí)存活率為94.0%，8 min時(shí)存活率為73.6%，因此可以得出0.1%升汞消毒的最佳時(shí)間為7min.。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)外植體消毒效果的影響

2.2 不同激素配比的培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)和增殖的影響

將消毒后的八寶景天莖段接種在不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基上，7d后進(jìn)行觀察，結(jié)果見表2。由表2可以看出不同濃度6-BA和NAA組合對(duì)八寶景天莖段不定芽誘導(dǎo)和增殖有明顯的影響。在不同激素配比的培養(yǎng)基上，八寶景天莖段芽點(diǎn)處均能誘導(dǎo)出不定芽，培養(yǎng)20d 后進(jìn)行觀察，莖段兩端膨大，不定芽開始長(zhǎng)大，有單生或叢生。但不定芽的誘導(dǎo)率有很大的差異。當(dāng)NAA濃度為0.2、0.3 mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度的升高，不定芽的誘導(dǎo)率增大，最大值分別為94.4%、92.8%； NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，不定芽的誘導(dǎo)率先升高后下降，最大值為100%。因此，最適宜不定芽誘導(dǎo)的NAA濃度為 0.1 mg/L。6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率較高，Q5、Q6培養(yǎng)基不定芽誘導(dǎo)率分別為94.4%和92.8%，而Q4培養(yǎng)基不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到100%，因此，八寶景天莖段不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

表2 不同濃度6-BA和NAA組合對(duì)莖段不定芽誘導(dǎo)和增殖的影響

不同濃度的6-BA 和NAA 組合對(duì)繼代增殖的影響見表2。由表2可以看出：MS 培養(yǎng)基中6-BA 濃度為1.0 mg /L 的增殖系數(shù)為2.6-4.7，2 mg /L 的增殖系數(shù)為7.2-11.2，3mg /L的增殖系數(shù)為11.6-15.1，表明在一定濃度范圍內(nèi)，較高濃度的6-BA有利于芽的增殖，NAA 是促進(jìn)莖段不定芽增殖的重要激素。當(dāng)添加少量NAA 時(shí)， 能顯著提高不定芽的增殖能力。6-BA 3.0mg /L+0.1mg/L NAA 為八寶景天最佳的繼代增殖培養(yǎng)基。

2.3 生根培養(yǎng)基的篩選

將高度達(dá)2-3 cm的不定芽接種到已配制好的生根培養(yǎng)基中，一周左右即可生根，20 d統(tǒng)計(jì)生根率，結(jié)果見表3。由表3可以看出，是否添加生長(zhǎng)素對(duì)根的誘導(dǎo)影響較大。添加生長(zhǎng)素的1/2MS培養(yǎng)基生根率均達(dá)到了100%，不添加激素的1/2MS培養(yǎng)基上生根率僅為64.8%，且根長(zhǎng)度短、生長(zhǎng)緩慢。將不定芽轉(zhuǎn)入NAA、IBA均為0.1mg/L的1/2MS培養(yǎng)基上，根長(zhǎng)度長(zhǎng)、粗壯，生長(zhǎng)較快，當(dāng) NAA、IBA均為0.3mg/L時(shí)，不定芽基部膨大，從基部邊緣開始生根，細(xì)弱，生長(zhǎng)緩慢。NAA、IBA對(duì)根的形成在低濃度表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用。綜上所述，確定最佳生根培養(yǎng)基為：1/2MS+NAA0.1mg/L或1/2MS+IBA0.1mg/L。

表3 不同濃度生長(zhǎng)素NAA、IBA對(duì)八寶景天不定芽生根的影響

2.4 練苗和移栽

選取生長(zhǎng)健壯、根系發(fā)達(dá)的無(wú)菌苗，去掉培養(yǎng)瓶的封口膜，2 d后將無(wú)菌苗取出，洗凈根部培養(yǎng)基，然后將其移栽至盛有高壓滅菌土的小盒中，浸透水后放置在適宜的環(huán)境下培養(yǎng)，成活率達(dá)98.4%以上。

3 結(jié) 論

外植體在接種之前需經(jīng)嚴(yán)格地滅菌。在使用不同的消毒劑時(shí)，需要考慮使用濃度和處理時(shí)間[11]，盡量殺死植物材料所攜帶的微生物[12]。試驗(yàn)以八寶景天的莖段為外植體，最佳消毒方法為75%乙醇30s+0.1%HgCl26min。不定芽誘導(dǎo)試驗(yàn)中，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)100%。NAA為0.1mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，不定芽誘導(dǎo)率先升高后下降，可能是由于細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值過(guò)高抑制了八寶景天不定芽的誘導(dǎo)。這一結(jié)果與劉曉東等對(duì)香蓼帶芽莖段組織培養(yǎng)的研究結(jié)果相同[13]。在繼代增殖培養(yǎng)過(guò)程中，不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.1mg/L，增殖系數(shù)達(dá)到15.1，低于任爽英等的“八寶景天頂芽增殖系數(shù)為22”的結(jié)果[7]。這一結(jié)果可能與所用外植體及其基因型不同有關(guān)。在生根過(guò)程中，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1mg/L或1/2MS+IBA 0.1mg/L，不定芽的生根率達(dá)100%，明顯高于馮紫洲等的“八寶景天中獲得的生根率為86.67%”的結(jié)果[9]。為解決八寶景天的批量生產(chǎn)及其在園藝的綠化和裝扮中發(fā)揮更大的優(yōu)勢(shì)提供技術(shù)參數(shù)和依據(jù)。