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    桔梗皂苷-納米硒復(fù)合物對(duì)CCl4致小鼠肝損傷的保護(hù)作用①

    2019-08-08 01:45:26高金波侯麗然李國清張?jiān)平?/span>
    關(guān)鍵詞:雙酯聯(lián)苯桔梗

    高金波, 侯麗然, 李國清, 張?jiān)平埽?彭 翔

    (1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007; 2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007; 3.哈爾濱學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150080)

    0 引 言

    桔梗為藥食兩用植物,是桔???Campanulaceae)植物桔梗 Platycodon grandiflorum (Jacq.)A. DC. 的干燥根,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。已有研究表明桔梗中的化學(xué)成分主要有:桔梗皂苷、酚類化合物、黃酮類化合物等[2,3]。其中的桔梗皂苷具有祛痰、鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝、降脂等作用[4]。根據(jù)桔梗皂苷的結(jié)構(gòu)可知:分子中和分子間均有一定的網(wǎng)狀空間,溶液中的小分子或離子可以進(jìn)入網(wǎng)狀空間,具有一定的分散能力[5]。硒是人體的必須微量元素之一,是人體合成許多酶的重要組成部分,具有清除自由基、解除重金屬的毒害與致癌性物質(zhì)傷害[6]。自1994年張勁松、高學(xué)云博士率先研制出納米硒之后,紅色的納米硒因其低的毒性和高的生物活性越來越備受關(guān)注[7]。近年來關(guān)于納米硒的應(yīng)用研究主要集中在光電子方面,鮮有利用納米硒參與谷胱甘肽過氧化物酶進(jìn)行保肝的研究。筆者已開展過利用納米硒進(jìn)行保肝的研究[8,9],取得了一些進(jìn)展,為尋找更穩(wěn)定和更好的保肝物質(zhì),本文利用桔梗中的總皂苷作為分散劑制備紅色的納米硒,研究其對(duì)CCl4所致的肝損傷的保護(hù)作用,希望為保肝護(hù)肝提供有益的參考。

    1 儀器與試劑

    AU 2700全自動(dòng)生化分析儀(1600T/h,日本OLYMPUS公司生產(chǎn)),TGL16M臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī) 上海赫田科學(xué)儀器有限公司,B×41 光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS )。

    SPF級(jí)昆明種雄性小鼠(佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);CCl4(分析純,天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);聯(lián)苯雙酯滴丸(1.5mg×500丸,北京協(xié)和藥廠);谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)試劑盒(日本,和光純藥工業(yè)株式會(huì)社);丙二醛(MDA)試劑盒和還原型谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(南京建成生物工程研究所);其他試劑均為分析純。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 桔梗總皂苷的提取與處理

    取干燥的桔梗,粉碎,過篩,稱取50 g,30倍的蒸餾水,在60℃水浴,超聲頻率為1000W條件下超聲60 min,四層紗布過濾,濾渣在上述條件下重復(fù)提取1次,合并濾液。濾液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,濃縮液上101型大孔樹脂柱,分別用蒸餾水和70%的乙醇洗脫,收集乙醇部分,濃縮至干,得桔??傇碥?。

    2.2 以桔??傇碥諡榉稚┲苽銹LD-NSe0的方法

    稱取0.1 g的桔??傇碥?,加500 mL蒸餾水,在溫度40 ℃下加入亞硒酸鈉0.10g,攪拌30min,使其均勻地分散,再以1 mL/min的速度滴加維生素C(Na2SeO3與Vc的摩爾比為1∶3),繼續(xù)攪拌4 h,濃縮后,醇沉,離心。

    2.3 桔梗皂苷-納米硒復(fù)合物的保肝作用研究

    2.3.1 動(dòng)物分組及模型的建立

    將48只雄性昆明種小鼠(SPF級(jí))隨機(jī)分成6組,分別為正常組,陰性模型組,陽性聯(lián)苯雙酯組,高、中、低劑量組,每組8只。正常飼養(yǎng)3d,稱重,PLD-NSe0低、中、高劑量組分別按照40 mg/kg、50 mg/kg、60 mg/kg(含硒量)灌胃給藥,陽性組灌聯(lián)苯雙脂200 mg/kg,正常組和陰性模型組按照100mL/kg灌胃生理鹽水,連續(xù)灌胃給藥14d,在第7d和第14d給藥1h后,稱重,除正常組外,各組小鼠按照10 mg/kg腹腔注射0.2%的CCl4橄欖油溶液。

    2.3.2 血清和肝組織樣本制備

    在第14 d給藥24 h后,稱體重,眼球取血,血液于3500 r/min條件下低溫離心15 min,取上清作為血清樣本。將小鼠處死后摘取肝組織,用生理鹽水沖洗,濾紙拭干,稱重,計(jì)算肝指數(shù)(肝重/體重×100%),取肝臟組織0.2 g,加預(yù)冷的9倍于組織塊重的生理鹽水,制備成10 %的肝組織勻漿液。將勻漿以3500r/min離心10~15min,取上清液作為肝組織勻漿液,備用。

    2.3.3 血清肝功能各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)

    取血清樣本0.5mL于全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)的含量,用以評(píng)價(jià)肝功能損傷程度。

    2.3.4 肝組織中MDA含量和GSH-Px活力測(cè)定

    取肝組織勻漿液,按照試劑盒要求測(cè)定并計(jì)算肝組織勻漿中MDA含量和GSH-Px活力。

    2.3.5 病理組織學(xué)觀察

    選取小鼠右側(cè)肝葉,置于10% 中性甲醛溶液中固定,按常規(guī)方法制備蠟塊,切片,蘇木素-伊紅 (HE) 染色,封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織細(xì)胞的變化。

    2.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    用統(tǒng)計(jì)SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,在多組肝功能各項(xiàng)指標(biāo)、MDA和GSH-Px的數(shù)據(jù)分析中,采用SPSS中的單因素方差分析法(One-Way Anova),進(jìn)行多重比較時(shí),采用SPSS中的最小顯著性法(LSD)。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 對(duì)小鼠體重的影響

    按照2.3.1方法小鼠造模成功后,將小鼠稱重并計(jì)算各組小鼠體重的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差,匯總與表1。

    表1 小鼠體重(g)值

    根據(jù)0d~7d(ΔW0d-7d)的結(jié)果比較分析,正常組與聯(lián)苯雙酯組增加幅度較小,PLD-NSe0組的體重差隨劑量增加,小鼠體重增長幅度變大。陰性組與低劑量組增長幅度幾近相同。7d~14d與0d~7d體重差比較可知,正常組、聯(lián)苯雙酯組、PLD-NSe0高、中劑量組體重增長速度近乎相同,PLD-NSe0劑量組體重増長變緩,陰性組體重增長最慢,可推測(cè)CCl4造成小鼠肝細(xì)胞損傷,得了肝損傷,從而導(dǎo)致消化道不適,造成食欲差的結(jié)果。

    3.2 對(duì)小鼠肝重及肝臟指數(shù)

    由肝指數(shù)與組別之間繪制的柱狀圖如圖1可看出,與正常組比較,陰性組小鼠肝重和肝指數(shù)存在極顯著性差異(p<0.01)表明造模成功,而陽性聯(lián)苯雙酯組較正常組差異較小,說明聯(lián)苯雙酯具有保護(hù)和治療作用;與陰性組比較,PLD-NSe0藥物治療組肝重與肝指數(shù)均明顯低于陰性組且存在顯著性差異(p<0.05),與正常組和聯(lián)苯雙酯組無明顯差異,說明PLD-NSe0有明顯的保護(hù)肝臟和治療肝損傷的效果,且治療效果與PLD-NSe0的劑量正相關(guān),可推測(cè)PLD-NSe0有助于修復(fù)肝細(xì)胞,使肝重指數(shù)降低的作用。

    3.3 血清中酶的各種酶的變化

    測(cè)定血清中TP、ALB、ALT、AST、GLB、ALP的酶活力,以評(píng)價(jià)肝損傷程度,測(cè)定結(jié)果見表2。

    表2 小鼠肝功能測(cè)定結(jié)果

    注:與正常組比較,*:p<0.01 ;與陰性組比較,#:p<0.05 ◆:p<0.01;與陽性組比較,^:p<0.05, ☉:p<0.01

    由表2知,陰性組與正常組相比,陰性組小鼠血清中ALT、AST、ALP、GLB水平明顯升高,均有極顯著性差異(p<0.01);陰性組小鼠血清中TP、ALB水平明顯低于正常組,有極顯著性差異(p<0.01),說明CCl4引起的小鼠急性肝損傷的模型制造成功。聯(lián)苯雙酯陽性組與陰性模型組相比TP、ALB、ALT、AST、ALP、GLB均有極顯著性差異(p<0.01),且與正常組差異較小,說明聯(lián)苯雙酯滴丸有明顯預(yù)防保護(hù)作用。PLD-NSe0低、中劑量治療組較陰性組的TP、ALB水平明顯升高,ALT、AST、ALP、GLB水平較陰性組明顯降低,高劑量組則存在極顯著性差異(p<0.01),說明高劑量組治療效果與陽性聯(lián)苯雙酯組相當(dāng)。

    圖1 肝重指數(shù)柱圖

    3.4 PLD-NSe0對(duì)肝組織中MDA的含量的影響

    由于CCl4在體內(nèi)產(chǎn)生自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng),從而損傷肝細(xì)胞,而丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物,因此MDA的含量可以間接反應(yīng)出肝細(xì)胞的破壞程度。由表3小鼠肝組織中MDA的含量結(jié)果可知,陰性組與正常組比較,陰性組中的MDA含量劇增,較正常組存在極顯著性差異(p<0.01);聯(lián)苯雙酯組與陰性組比較,MDA含量降低存在極顯著性差異(p<0.05),說明聯(lián)苯雙酯滴丸起到了保護(hù)和治療效果,PLD-NSe0組隨著劑量的增加,MDA含量降低,且PLD-NSe0高劑量組較聯(lián)苯雙酯組無顯著性差異,說明PLD-NSe0也具有保護(hù)肝臟的作用,且效果與劑量成正比。

    表3小鼠肝組織中MDA的含量和GSH-Px活力值

    MDAGSH-Px 正常組7.00±1.86241.27±45.99陰性對(duì)照組12.27±2.49?163.47±24.45?陽性對(duì)照組8.54±1.36 ?232.10±58.70?多糖高劑量組8.82±2.20220.80±42.37#多糖中劑量組9.22±1.05 196.11±34.20?#多糖低劑量組10.95±1.54?☉169.98±47.26?^

    注:與正常組比較,*:p<0.01 ;與陰性組比較,◆:p<0.01;與陽性組比較,☉:p<0.01

    3.5 PLD-NSe0對(duì)肝組織中GSH-Px活力的影響

    谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是生物體內(nèi)廣泛存在的一種過氧化物分解酶,其活力降低會(huì)使機(jī)體抗氧化能力下降,由表3中GSH-Px活力值可看出,陰性組與正常組比較,陰性組較正常組GSH-Px活性降低,并存在極顯著性差異(p<0.01),說明造模成功;PLD-NSe0治療組與陰性組比較,PLD-NSe0治療組均可使GSH-Px活性升高,且PLD-NSe0高、中劑量組與陰性組存在顯著性差異(p<0.05),推測(cè)PLD-NSe0可增強(qiáng)GSH-Px的活力,修復(fù)損傷的肝細(xì)胞,起到保肝作用。

    3.6 肝組織病理學(xué)結(jié)果

    圖4為肝組織HE的染色結(jié)果。由圖4可以看出,正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清楚,細(xì)胞排列整齊,邊界明顯,肝組織細(xì)胞沒有水腫、玻璃樣變性等;模型組肝組織細(xì)胞形態(tài)模糊,組織細(xì)胞有明顯的氣球樣變性和玻璃樣變性,且嗜伊紅增強(qiáng),說明肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重;聯(lián)苯雙酯組肝細(xì)胞水腫減輕,嗜伊紅現(xiàn)象減弱,肝細(xì)胞排列較為整齊,形態(tài)較為清晰;PLD-NSe0低劑量組較模型組嗜伊紅面積減小,水腫現(xiàn)象減輕;PLD-NSe0高劑量組和中劑量組相對(duì)于陰性組而言嗜伊紅面積和玻璃樣變組織細(xì)胞均明顯減少,細(xì)胞核明顯,形態(tài)清晰,幾乎沒有細(xì)胞水腫,與聯(lián)苯雙酯組基本相近,表明PLD-NSe0高、中劑量有很好的保護(hù)肝組織和修復(fù)肝細(xì)胞損傷的作用。

    圖2 肝組織HE染色結(jié)果(HE染色,×200)

    4 結(jié) 論

    PLD-NSe0能夠降低由CCl4所致的急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST、ALP水平和GLB含量,升高TP、ALB含量,并能夠使肝組織中GSH-Px活力增強(qiáng),MDA含量降低。證明PLD-NSe0對(duì)急性肝損傷有一定治療注作用,且治療效果高劑量組>中劑量組>低劑量組,高劑量組與陽性相對(duì)照組治療效果經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析無顯著差異,即療效相當(dāng)。可為PLD-NSe0藥用價(jià)值的進(jìn)一步開發(fā)和綜合利用奠定理論基礎(chǔ),并為臨床防治肝病用藥的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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