丁酸氧化菌群對抗生素及活性炭協(xié)同作用響應

馮高 張昱晨 茍敏 陳婭婷

（四川大學建筑與環(huán)境學院 環(huán)境生物技術研究中心，成都 610065）

厭氧消化技術因其高效的生物降解性和高能量回收率，現(xiàn)已成為治理有機固體廢棄物和廢水的核心生物技術。大分子有機物（纖維素、淀粉和蛋白質等）在水解菌和發(fā)酵菌的作用下分解為小分子有機物（丁酸、丙酸和乙醇等）及H2和CO2，而后在互營有機酸氧化菌的作用下分解為乙酸、H2和CO2，最后嚴格厭氧的產(chǎn)甲烷古菌利用H2和乙酸，通過多種途徑產(chǎn)生甲烷［1-2］。揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acid，VFA）作為厭氧消化過程中重要的中間產(chǎn)物，其氧化降解是厭氧消化限速步驟。目前關于乙酸和丙酸互營氧化的研究較多，而丁酸作為其中一類VFA，在厭氧消化研究中也具有重要意義。有研究表明，在奶制品及肉制品加工廠廢水的厭氧處理過程中，丁酸約占31%［3］。此外，丙酸氧化菌Smithella通過歧化途徑將丙酸轉化為丁酸后再進行氧化分解［4-5］，丁酸作為中間產(chǎn)物可影響丙酸降解過程。丁酸氧化過程中（C4H8O2+ 2H2O →2CH3COOH + 2H2）ΔG大于0，所以丁酸氧化菌需與產(chǎn)甲烷古菌形成互營，降低反應產(chǎn)物H2的分壓，才能完成代謝［6］。

實際環(huán)境中，厭氧消化過程極易受各類抑制劑的影響［7-9］。當抑制物濃度達到臨界水平時，會影響甲烷產(chǎn)生，造成甲烷產(chǎn)量下降［10-12］，其根本原因是對功能微生物類群的抑制，從而破壞有機物轉化為甲烷過程中多種營養(yǎng)微生物間的互作關系［13］。豬糞、牛糞和雞糞等動物糞便中通常含有高濃度的獸藥抗生素作為飼料添加劑，用于提高產(chǎn)量或控制疾?。?4］，高濃度抗生素可能導致厭氧消化過程的抑制或失敗。目前我國最常用的人畜用抗生素是氟喹諾酮類、磺胺類和四環(huán)素類抗生素［15］。其中，氯四環(huán)素（Chlortetracycline，CTC）在實際畜禽糞便中濃度高達100 mg/L［16］，可抑制部分革蘭氏陰性菌（如產(chǎn)甲烷古菌）的活性，從而抑制整個厭氧消化過程［17］。因此，研究抗生素對互營丁酸氧化群落的結構和活性的影響，對于制定削減抑制和保持反應器穩(wěn)定運行的對策至關重要。然而目前對相關微生物群落的結構及其對抑制物的響應仍缺乏系統(tǒng)的認識。

互營氧化產(chǎn)甲烷過程中，有機酸氧化菌與產(chǎn)甲烷古菌間的電子傳遞方式有氫氣轉移、甲酸轉移和直接電子轉移［18］。種間直接電子傳遞（Direct interspecies electron transfer，DIET） 是 最 新 的 一種互營方式，其電子傳遞不需要氫氣或甲酸載體，節(jié)省了能量的同時，傳遞也不受擴散速度的影響，因此具有極高的電子傳遞效率。目前報道的產(chǎn)甲烷體系中，能進行DIET的微生物主要包括Geobacter sulfurreducens、Geobacter metallireducens、Methanosaeta harundinacea和Methanosarcina barkeri［19-20］，其直接電子傳遞過程主要是通過Geobacter細菌的導電性菌毛實現(xiàn)［21］。Zhao 等［22］通過在沼氣池中添加Fe3O4富集得到Syntrophomonas和Methanosaeta證實Syntrophomonas和Methanosaeta也可能存在DIET過程。近年來，研究發(fā)現(xiàn)導電顆粒物質（如活性炭、生物炭和鐵氧化物等）也可作為電子傳遞體參與直接電子傳遞過程［23-26］。其中，顆?；钚蕴勘缺砻娣e大，具備良好的導電性和抗腐蝕性［27］，在研究導電物質介導DIET過程中廣泛應用［28-29］。

本研究構建了以丁酸為唯一碳源的厭氧消化反應器，在穩(wěn)定運行條件下，通過16S rRNA的高通量測序研究互營丁酸氧化群落對抑制物的響應。此外，在抑制物存在條件下，添加顆?；钚蕴浚℅ranular active carbon，GAC），研究互營有機酸氧化菌和產(chǎn)甲烷古菌間是否可通過GAC進行直接電子傳遞，以及在CTC和GAC協(xié)同作用下，微生物群落結構和關鍵微生物活性的動態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 以丁酸為唯一碳源的反應器構建及運行

本研究采用工作體積為1.8 L的全混流連續(xù)厭氧消化反應器（Continuous stirred tank reactors，CSTR）。反應器原始接種污泥為四川省某豬場常溫厭氧消化污泥。反應器在37℃，0.05 d-1稀釋率條件下運行，供給以丁酸為唯一碳源的合成廢水（TOC濃度為8 000 mg/L）。反應器構建及合成廢水成分同此前研究［30］。反應器穩(wěn)定運行500 d后，收集其微生物群落進行后續(xù)實驗。

1.2 批次抑制及添加活性炭實驗

從反應器中取出18 mL混合液，倒入充滿氮氣的50 mL培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)瓶頂空用純氮氣置換3 min后，用丁基橡膠塞和鋁密封。為消除混合液中殘余的有機酸，將培養(yǎng)瓶置于37℃的搖床中預培養(yǎng)1 h。預培養(yǎng)后，在培養(yǎng)瓶中加入不同濃度的CTC作為抑制劑，并加入終濃度為2 000 mg/L丁酸鈉作為碳源。CTC濃度范圍為20-60 mg/L。

根據(jù)對不同濃度CTC的耐受情況，分別選擇低濃度和高濃度的CTC，并根據(jù)預實驗結果添加終濃度為3 mg/L的GAC，以考察抑制劑及GAC對互營丁酸降解微生物群落的影響。GAC來源于石家莊宏森活性炭有限公司，電子交換能力（Electron exchange capacity，EEC） 為 0.78 mmol e-/g， 過40-60目篩后備用。實驗設置如表1所示。培養(yǎng)瓶中分別添加40 mg/L和50 mg/L的CTC且無GAC的處理命名為C1和C2，培養(yǎng)瓶中分別添加上述兩種濃度的CTC且添加GAC的處理命名為GC1和GC2。數(shù)字“1”表示“低抑制”，數(shù)字“2”表示“高抑制”。此外，培養(yǎng)瓶中加入丁酸鹽作為微生物生長的碳源，初始濃度均為2000 mg/L。所有實驗組設置3個平行樣品。將培養(yǎng)瓶置于37℃搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)18 h后，檢測產(chǎn)氣量及培養(yǎng)液中VFAs的濃度，每個處理選取2個平行樣品進行微生物群落分析。

表1 批次抑制及添加活性炭實驗設置

1.3 RNA提取、反轉錄和高通量測序

培養(yǎng)18 h后，收集全部污泥培養(yǎng)液提取微生 物 群 落 總 RNA［31］。 采 用 PrimeScript RT reagent Kit試劑盒及隨機引物對RNA進行反轉錄。引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'） 擴 增 細 菌16S rRNA基因V3-V4高變區(qū)。采用古菌通用引物524F10extF（5'-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3'） 和Arch958RmodR（5'-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3'）擴增古菌16S rRNA基因V4-V6高變區(qū)。雙向引物加入樣品特異的12 bp 條形碼序列（barcode）。PCR反應體系如下：總體積 25 μL，包括0.4 μL Fast Pfu聚合酶，4 μL 5×Fast Pfu聚合酶緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，正反向引物各1.6 μL和10 ng cDNA模板。PCR 反應條件如下：95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s（27個循環(huán)），72℃最終延伸10 min。所有樣品 PCR 產(chǎn)物等摩爾混合并用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒及QuantiFluorTM-ST進行純化和定量，合格后用于 Illumina HiSeq2000系統(tǒng)完成測序。

1.4 生物信息學及統(tǒng)計學分析

利用最小顯著差數(shù)（The least significant difference，LSD）對各處理組進行顯著性檢驗，差異顯著水平設為P＜ 0.05。通過 Illumina 測序獲得原始配對數(shù)據(jù)后，首先利用Trimmomatic軟件（版本 0.36）［32］去除質量評分低于30的序列并利用FLASH 軟件（版本 1.2.11）進行序列拼接［33］，以獲得16S rRNA基因中整個V4-V6高變區(qū)的序列。對序列進行降噪、降低測序錯誤和去除嵌合體處理后，根據(jù)上述特有的12 bp的barcode，將上述高質量序列分配到各個樣品中，再按照97%的相似性劃 分 OTU（Operational taxonomic unit，OTU）。 最后，將OTU代表序列與Silva（SSU123）16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，按照0.7的置信度對OTU進行物種分類。利用Spearman等級相關系數(shù)分析環(huán)境因素對微生物群落結構的影響。利用R軟件（https：//www.r-project.org/）計算Spearman等級相關系數(shù)及相應P值（P＜0.05則為統(tǒng)計學上顯著性相關）。利用HemI（Heatmap Illustrator，版本1.0，http：//hemi.biocuckoo.org/）創(chuàng)建熱圖。利用開源平臺Cytoscape_v.3.6.1生成共現(xiàn)網(wǎng)絡，用以可視化微生物類群間相互作用。選擇相對豐度排名前30的微生物屬來構建網(wǎng)絡。兩個節(jié)點之間的連接表示強（| r |＞ 0.5）和顯著（P＜0.05）Spearman相關性。每個節(jié)點的大小與顯著的正/負相關（即度）的數(shù)量成比例；兩個節(jié)點之間的每個連接的厚度與Spearman的相關系數(shù)（r）成比例，范圍從| 0.5 |到| 1 |。

1.5 反應器理化參數(shù)測試

反應器中懸浮固體（Suspended solids，SS）、揮發(fā)性懸浮固體（Volatile suspended solids，VSS）、總有機碳（Total organic carbon，TOC）和VFAs等參數(shù)的測試方法同此前研究［34］。

1.6 核苷酸序列登記號

原始測序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI（Accession number：PRJNA544829）。

2 結果

2.1 反應器運行情況

實驗期間，以丁酸為唯一碳源的反應器已在0.05 d-1稀釋率下穩(wěn)定運行500余天（圖1）。反應器pH保持在7.5，產(chǎn)氣量穩(wěn)定在400 mL/d（圖1）。丁酸及乙酸濃度均低于100 mg/L，表明反應器中的丁酸被微生物群落完全礦化。VSS平均濃度為1.86 g/L。在運行550 d和610 d間采集反應器中混合液樣品進行微生物群落分析和批量抑制及添加GAC實驗。

2.2 原始反應器中的微生物群落

圖1 以丁酸為唯一碳源的反應器運行情況（37℃，0.05 d-1）

為研究反應器中的活性微生物群落，從反應器污泥中提取兩個平行RNA樣品并進行16S rRNA高通量測序?；?6S rRNA序列中97%的相似性，共獲得247個OTU。在門水平，細菌主要類群（相對豐度 ＞ 3%）為Firmicutes（16.0%），Proteobacteria（13.2%），Bacteroidetes（9.6%） 和Synergistetes（3.3%）（圖2）。在屬水平，優(yōu)勢細菌屬（相對豐度 ＞ 2%）分別是Syntrophomonas（11.6%），unclassifiedSphingobacteriales（8.9%），unclassifiedHydrogenophilaceae（7.0%），Tepidanaerobacter（2.74%）和 unclassifiedSynergistaceae（2.08%）（ 圖 2）。 古菌群落中，主要古菌屬為Methanosaeta（48.5%），Methanoculleus（3.4%） 和Methanobacterium（2.7%）（圖 2）。

圖2 不同處理下微生物優(yōu)勢屬的相對豐度

2.3 抗生素及添加活性炭對產(chǎn)甲烷的影響

為研究不同濃度CTC對產(chǎn)甲烷的影響，選擇20-60 mg/L濃度的CTC進行產(chǎn)甲烷抑制測試。結果顯示，20 mg/L濃度的CTC對產(chǎn)甲烷無明顯抑制，30-50 mg/L條件下產(chǎn)氣量分別降低17.3%，36.5%和80.8%，60 mg/L時幾乎無產(chǎn)氣。根據(jù)對CTC的耐受情況，最終選擇低濃度（40 mg/L）和高濃度（50 mg/L）的CTC進行抑制實驗，并添加GAC研究其對產(chǎn)甲烷過程的影響。

批次抑制及添加GAC實驗中，丁酸初始濃度為2000 mg/L。培養(yǎng)18 h后，產(chǎn)氣量、丁酸和乙酸濃度結果如圖3所示。培養(yǎng)18 h后，在低（C1，40 mg/L）和高（C2，50 mg/L）濃度CTC條件下，產(chǎn)氣量分別降低40.4%和49.3%（圖3-a），丁酸降解速率分別降低44.2%和51.3%（圖3-b），乙酸濃度分別降低31.2%和45.4%（圖3-c），表明CTC對丁酸降解有明顯抑制作用。

在添加GAC的處理中（圖3），無CTC條件下，加入GAC導致產(chǎn)氣量降低2.9%，丁酸降解速率無明顯變化，乙酸濃度增加7.0%。當GAC和CTC同時存在時（GC1和GC2），產(chǎn)氣量分別降低48.5%和64.7%（圖3-a），丁酸降解率降低48.8%和72.6%（圖3-b），乙酸濃度降低34.7%和58.3%（圖3-c）。

圖3 不同處理下產(chǎn)氣量（a）、丁酸濃度（b）和乙酸濃度（c）

2.4 抗生素及添加活性炭對丁酸氧化群落活性的影響

為研究CTC及添加GAC對微生物類群活性的影響，通過計算Spearman相關系數(shù)以表明微生物群落結構與環(huán)境因子之間的相關性（圖4）。在CTC抑制條件下，有7種OTU（Syntrophomonas、Citrobacter、Methylobacter、Mesotoga、Mycobacterium、Desulfomonile和Syntrophobacter）的相對活性與CTC濃度呈正相關，表現(xiàn)出對CTC 的耐受性；其中Mycobacterium和Syntrophobacter呈顯著正相關（P＜ 0.05），表明相對其他細菌，該微生物對CTC有較強的耐受性和適應能力。相反地，有8種OTU（Tepidanaerobacter、unclassifiedSpirochaetaceae、unclassifiedSynergistaceae、unclassifiedSyntrophaceae、unclassifiedSphingobacteriales、unclassifiedHydrogenophilaceae、Azonexus和Geobacter） 與CTC濃度呈負相關，表明其可能不耐受CTC；其 中 unclassifiedSphingobacteriales、unclassifiedHydrogenophilaceae和Geobacter受到顯著抑制（P＜ 0.05）（圖4-a）。此外，不同濃度抑制劑影響不同微生物類群（圖4-b）。低濃度CTC處理時，僅有 3種 OTU的 活 性（Methanoculleus、unclassifiedHydrogenophilaceae和 unclassifiedSpirochaetaceae）受到較明顯的抑制，大部分OTU表現(xiàn)出耐受性，其中Methylobacter和unclassifiedMethylophilaceae的相對活性與CTC濃度呈顯著正相關；高濃度CTC抑制了大部分細菌的活性并顯著抑制了unclassifiedSphingobacteriales、Soehngenia和 unclassifiedMethylophilaceae的活性，只有3種OTU（Citrobacter、Syntrophobacter和Mycobacterium）表現(xiàn)出耐受性，其中Mycobacterium的相對活性與CTC濃度呈顯著正相關（P＜ 0.05）（圖 4-b）。

添加GAC條件下，有6種OTU（unclassifiedFirmicutes、unclassifiedSynergistaceae、unclassifiedSphingobacteriales、unclassifiedHydrogenophilaceae、Azonexus和Geobacter）相對活性與GAC呈明顯正相 關； 有 5種 OTU（Citrobacter、Methylobacter、Mesotoga、Mycobacterium和Syntrophobacter） 相對活性與GAC呈負相關，其中Citrobacter的活性呈顯著負相關（P＜ 0.05）（圖 4-a）。低濃度 CTC添加GAC處理條件下有五種OTU（Geobacter、Syntrophomonas、Methylomonas、unclassifiedAnaerolineaceae和 unclassifiedComamonadaceae） 的相對活性與GAC呈明顯正相關，其中Geobacter在低濃度CTC處理時被抑制，添加GAC后表現(xiàn)出耐受性；而Mycobacterium對單獨存在的CTC表現(xiàn)出耐受性，添加GAC其相對活性明顯降低；高濃度CTC添加GAC處理時，大部分OTU的相對活性呈負相關，只有3個OTU（Methanosaeta、unclassifiedComamonadaceae和Citrobacter）呈正相關趨勢。相比于高濃度CTC處理，添加GAC后Methanosaeta和unclassifiedComamonadaceae的活性明顯增強（圖4-b）；而Mycobacterium的活性明顯降低，與低濃度CTC條件下對GAC的響應相同。

2.5 基于群落和抗生素及添加活性炭的網(wǎng)絡分析

共現(xiàn)網(wǎng)絡分析用于研究群落中優(yōu)勢屬之間的直接或間接相互作用（圖5）。為了從整體水平探討綜合條件對微生物群落的影響，選取所有處理組數(shù)據(jù)進行分析。在所有處理條件下相關性網(wǎng)絡圖中（圖 5-a），與Methanosaeta、Methanoculleus相聯(lián)系的OTU均呈負相關性，如Thermoclostridium、unclassifiedFirmicutes、Azonexus等。Syntrophomonas和Mesotoga呈正相關聯(lián)系，因為Mesotoga可以利用Syntrophomonas的代謝產(chǎn)物乙酸。與Geobacter相關的OTU較少，其中僅有Azonexus、unclassifiedSphingobacteriales和unclassifiedSynergistaceae與其呈正相關，且這3種OTU的生物活性都與GAC呈正相關。

在僅有CTC處理的相關性網(wǎng)絡圖中，群落中的“中樞”是unclassifiedFirmicutes、unclassifiedComamonadaceae、Tepidanaerobacter和Methanoculleus（圖5-b）。其中，unclassifiedFirmicutes和unclassifiedComamonadaceae兩個簇內大部分OTU（如Mesotoga、Syntrophomonas和Azonexus等）間呈正相關聯(lián)系，僅有Methanosaeta與這兩個“中樞”呈負相關聯(lián)系。此外，unclassifiedFirmicutes、unclassifiedComamonadaceae和Methanobacterium與Mesotoga呈正相關性。Tepidanaerobacter為“中樞”的簇中，unclassifiedHydrogenophilaceae和 unclassifiedSphingobacteriales與“中樞”有很強的相關性?！爸袠小睘镸ethanoculleus的簇中大部分OTU聚集為負相關趨 勢， 如Soehngenia、unclassifiedMethylophilaceae和Brachymonas。

圖4 不同添加物（a）和不同處理下（b）環(huán)境因子和主要菌屬間Spearman相關性熱圖

3 討論

原始反應器細菌類群中，F(xiàn)irmicutes，Proteobacteria，和Bacteroidetes常見于厭氧消化系統(tǒng)［35-36］。屬于Clostridia的Syntrophomonas（OTU133）是已知的丁酸氧化菌，該菌株可通過β-氧化途徑將丁酸降解為乙酸和H2［37］。屬于Sphingobacteriia的 unclassifiedSphingobacteriales（OTU233） 與Sphingobacteriales（HQ692029） 具 有 97% 的 序 列相似性，該菌在甜菜硅藻的中溫厭氧消化反應器中被檢測出，可降解包括蛋白質和碳水化合物在內的復雜大分子有機物［38］。屬于Betaproteobacteria的 unclassifiedHydrogenophilaceae（OTU234） 與Planifilum（NR_040940）具有88.5%的序列相似性，Planifilum是堆肥產(chǎn)生的生物氣溶膠中的優(yōu)勢嗜熱細 菌［39］。 屬 于Firmicutes的Tepidanaerobacter（OTU210） 與TepidanaerobacteracetatoxydansRe1（EU386163）具有99%的序列相似性，該菌分離自含有高濃度銨的中溫污泥反應器，為一類互營乙酸氧化細菌［40］。屬于Thermotogae的Mesotoga（OTU59）是已知的乙酸氧化細菌，在對苯二甲酸甲酯（Terephthalate，TA）產(chǎn)甲烷反應器中被發(fā)現(xiàn)，可降解TA分解代謝副產(chǎn)物乙酸［41］。屬于Synergistia的 unclassifiedSynergistaceae（OTU217）與SaccharofermentansM3/6T（NR_115340）具有94.7%的序列相似性，該菌株是從沼氣反應器中分離出的新菌種，可利用蛋白底物和糖類產(chǎn)乙酸、丙酸和異戊酸，有助于厭氧消化的水解產(chǎn)酸過程［42］。這些OTU與已知微生物序列的低相似性表明厭氧消化體系中也存在較多未知微生物物種。古菌群落中，優(yōu)勢古菌屬Methanosaeta是已知的乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，能利用乙酸產(chǎn)生CH4和CO2［43］。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)Methanosaeta可通過直接種間電子轉移（DIET）接受電子以消耗乙酸，表明厭氧消化中有機物轉化為CH4不僅僅是通過電子載體（如H2和甲酸）的擴散進行的［44］。目前已知Geobacter可通過導電菌毛參與DIET向產(chǎn)甲烷菌提供電子［45］。Zhao等［46］發(fā)現(xiàn)互營丁酸氧化菌Syntrophomonas也可能通過DIET與Methanosaeta互營生長［22］。另外兩個古菌屬Methanoculleus和Methanobacterium為氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，常見于反應器、填埋場、廢水和熱泉中。相較于高溫，中溫條件下氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌的生物活性相對偏弱［47］，因此本研究反應器中Methanoculleus和Methanobacterium的相對豐度較低。

圖5 基于Spearman相關性分析的共現(xiàn)微生物屬網(wǎng)絡

CTC對丁酸降解有明顯抑制作用，在厭氧消化過程中，由于底物、接種物、環(huán)境條件（溫度、pH）和馴化期的不同，抑制劑的抑制濃度范圍較大，CTC的抑制濃度通常在2-100 mg/L范圍內波動［10-12，48］。與抑制物單獨作用相比，添加GAC增強了抑制性，這可能是GAC吸附使抑制物和有機酸積累導致的結果。有研究表明GAC的導電性能加強微生物群落種間直接電子傳遞，有效促進互營產(chǎn)甲烷過程［49］，與本次實驗結果有所差異，可能是由與反應器和實際物料體系不同造成的。

環(huán)境因子和主要菌屬間Spearman相關性熱圖表明，相對其他細菌，丁酸氧化菌Syntrophomonas對CTC有一定的耐受性，其氧化丁酸產(chǎn)乙酸過程可能不會受到明顯抑制。作為丁酸氧化的產(chǎn)物，乙酸不僅可被Methanosaeta利用產(chǎn)甲烷，還可被乙酸氧化菌Tepidanaerobacter和Mesotoga氧化為CO2和H2，產(chǎn)生的CO2和H2將參與氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷過程［40］。本研究中Tepidanaerobacter的相對活性受到CTC的抑制，可能導致乙酸積累，從而抑制整個丁酸氧化過程。有研究表明，揮發(fā)性有機酸積累對厭氧消化過程中微生物有著致命的毒害作用［50］。Geobacter已被證實可以直接向產(chǎn)甲烷古菌傳遞電子并促進甲烷的生產(chǎn)［45］，本研究中，CTC顯著抑制了Geobacter的相對活性，可能阻斷其與古菌的電子傳遞過程。此外，群落中一些未知細菌（ 如unclassifiedSphingobacteriales和unclassifiedHydrogenophilaceae）受到CTC的明顯抑制，這些細菌可能為參與丁酸氧化的微生物提供必需的營養(yǎng)物質，從而影響關鍵菌的生長，因此有必要進一步研究這些未知細菌。Geobacter是目前唯一已知通過DIET傳遞電子的細菌，該細菌活性與GAC呈明顯正相關，表明添加GAC可能促進其參與直接電子傳遞過程，與此前研究結果一致［51］。在本研究中，添加GAC，最終甲烷產(chǎn)量降低2.9%-30.4%，可能是其他未知細菌（如unclassifiedFirmicutes和unclassifiedSphingobacteriales）與產(chǎn)甲烷古菌形成互營，導致Geobacter無法與古菌形成種間直接電子傳遞。此外，添加GAC處理中，Methanosaeta、Syntrophomonas和Mesotoga的相對活性降低，Mesotoga可將乙酸氧化為CO2和H2以供給氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌［52］，H2和CO2來源減少也可能導致甲烷產(chǎn)量的降低。低濃度CTC和GAC的共同處理增強了Syntrophomonas的相對活性，而乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌Methanosaeta的相對活性降低，可能由于丁酸氧化產(chǎn)生的乙酸未被及時消耗，導致乙酸積累并影響甲烷產(chǎn)生。高濃度CTC和GAC處理時，包括Geobacter在內的大部分微生物活性被抑制，直接電子傳遞過程的阻斷導致GAC的添加無明顯作用效果。

共現(xiàn)網(wǎng)絡分析提供了生態(tài)信息的可視化，可以闡明生物間相互作用，共享生理學或棲息地親緣關系［53］。密集連接的節(jié)點由較大的圓圈表示，表明該菌屬與其他類群具有更顯著的正相關或負相關，因此可能是群落中的重要微生物。最密集連接的節(jié)點被定義為“中樞”，是群落中其他成員的潛在代謝指標［54］。所有處理網(wǎng)絡分析結果表明，Geobacter可 能 與Azonexus、unclassifiedSphingobacteriales和unclassifiedSynergistaceae協(xié)同生長，GAC促進了Geobacter生長代謝，同時增強了它們的相對活性。屬于Betaproteobacteria的主要屬Azonexus與Azonexuscaeni菌株Slu-05（NR_041017）具有99%的序列相似性，該菌是從廢水處理廠的污泥中分離出的反硝化細菌［55］。Azonexus能夠在微氧條件下生長，但通常在產(chǎn)甲烷體系中檢測到［56-57］。屬于Synergistia的unclassifiedSynergistaceae可能通過氧化乙酸產(chǎn)生電子，并被產(chǎn)甲烷菌用于產(chǎn)生甲烷［45］。

在僅有CTC處理的相關性網(wǎng)絡圖中，Methanosaeta與兩個“中樞”（unclassifiedFirmicutes和unclassifiedComamonadaceae）呈負相關聯(lián)系，表明它們與乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌存在一定的競爭關系。此外，unclassifiedFirmicutes和unclassifiedComamonadaceae可能是Mesotoga生長代謝的伴生菌，增強了Mesotoga與Methanosaeta競爭乙酸時的優(yōu)勢。乙酸氧化細菌Mesotoga和丁酸氧化細菌Syntrophomonas與這兩個“中樞”都呈正相關趨勢，表明它們與有機酸氧化細菌具有密切的關系。Mesotoga和Methanobacterium呈正相關聯(lián)系，Mesotoga氧化乙酸產(chǎn)生的CO2可被氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌Methanobacterium利用，與此前研究結果相同［52］。Tepidanaerobacter為“中樞”的簇中，一些易受CTC影響的OTU（如unclassifiedHydrogenophilaceae和 unclassifiedSphingobacteriales）與“中樞”都有很強的相關性，它們被抑制的同時會影響Tepidanaerobacter的生物活性。

綜上所述，丁酸氧化菌（Syntrophomonas）和乙酸氧化菌（Mesotoga和Tepidanaerobacter）與群落中大部分細菌（如unclassifiedComamonadaceae、unclassifiedFirmicutes、unclassifiedSphingobacteriales等）呈正相關，它們的活性易受到CTC的抑制，從而影響乙酸和H2的產(chǎn)出，導致甲烷產(chǎn)量降低。產(chǎn)甲烷古菌（Methanosaeta和Methanoculleus）與其相 聯(lián) 系 的 細 菌（Azonexus、Thermoclostridium和unclassifiedChloroflexi等）均呈負相關性，而添加GAC增強了Geobacter以及與其呈正相關的細菌（Azonexus、unclassifiedSynergistaceae和 unclassifiedSphingobacteriales等）的活性，間接影響了產(chǎn)甲烷古菌生長代謝，致使產(chǎn)甲烷量降低。雖然添加GAC可以增強Geobacter等菌的活性，但是CTC對它們的抑制作用占主導地位。

4 結論

本研究利用以丁酸為唯一碳源的厭氧反應器，揭示了互營丁酸氧化群落結構和相互作用，研究互營丁酸氧化群落對CTC的響應，以及在CTC和GAC協(xié)同作用下，微生物群落結構和關鍵微生物活性的動態(tài)變化。結果表明，反應器群落中優(yōu)勢菌屬互營丁酸氧化菌Syntrophomonas和乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌Methanosaeta存在互營生長關系。CTC明顯抑制產(chǎn)甲烷量，盡管Syntrophomonas相對耐受CTC，但與其呈正相關的微生物（如unclassifiedFirmicutes和unclassifiedComamonadaceae）活性受CTC抑制。乙酸氧化菌Tepidanaerobacter受CTC抑制，可能導致代謝產(chǎn)物乙酸的積累從而降低丁酸氧化率。此外，添加GAC增強了Geobacter和Azonexus等細菌的活性，而產(chǎn)甲烷古菌（Methanosaeta和Methanoculleus）與其相聯(lián)系的細菌（Azonexus、Thermoclostridium和unclassifiedChloroflexi等）均呈負相關性，間接影響了產(chǎn)甲烷古菌生長代謝，從而導致產(chǎn)甲烷量降低。與處理實際物料的厭氧消化反應器相比，以丁酸為唯一碳源的厭氧反應器中，微生物群落結構較簡單，長期供給含丁酸的合成廢水可馴化出穩(wěn)定的微生物群落且各微生物類群間相互作用較緊密。因此，添加GAC雖可能促進Geobacter潛在的直接電子傳遞能力，但對關鍵有機酸氧化菌及產(chǎn)甲烷古菌并無明顯促進作用。后續(xù)可就實際物料厭氧消化體系中，微生物群落對抑制物的響應及導電介質介導直接電子傳遞過程進行深入研究。