一種耐鹽促生菌篩選、鑒定及對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響

孫培 王罡 張亞楠 李倩 季靜 楊丹 袁東 王暢 王昱蓉 王萍

（1. 天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300000；2. 天津市天大天福生物技術(shù)有限公司，天津 300000）

近年來(lái)，由于全球氣候的變化，土壤鹽漬化已成為日益嚴(yán)峻的環(huán)境問(wèn)題。高鹽作為一種主要的非生物脅迫［1］，對(duì)植物會(huì)產(chǎn)生滲透脅迫、質(zhì)膜傷害、離子不平衡以及代謝紊亂等傷害，從而抑制植株的生長(zhǎng)［2］。玉米（Zea maysL.）是世界上重要的糧食作物之一，廣泛地用于畜牧業(yè)、工業(yè)以及養(yǎng)殖業(yè)等產(chǎn)業(yè)［3］。但是玉米耐鹽性較差［4］，這極大限制了玉米在鹽漬化土壤上的生長(zhǎng)，制約了全球玉米的生產(chǎn)與發(fā)展，因此提高鹽漬化土地上玉米的產(chǎn)量及質(zhì)量，是我國(guó)科研工作者首要的任務(wù)之一。

根際促生菌能在一定程度上提高植物對(duì)干旱，高鹽和高溫等非生物脅迫的耐受性。Jiang等［5］分離出4種溶磷菌株，包括巨芽孢桿菌（YM13）、腸桿菌（YM14）、普羅維登氏菌（TPM23）和青貯黏液桿菌（TPMX5），研究表明這4種菌在鹽脅迫下具有高效的溶磷性，能夠提高花生的生物量，對(duì)花生的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。Lucio等［6］從油菜根際篩選分離得到芽孢桿菌LTAD-52，該菌能夠溶磷，可以增加油菜莖的干重，將油菜的產(chǎn)量從21%提高到44%。研究表明，在200 mmol/L的氯化鈉濃度下，將從紫蘇根際分離的黃色葡萄球菌F-11、黃志亨柳菌F-9以及巨芽孢桿菌F-58接種在玉米幼苗根際，這些菌都可以顯著減輕玉米幼苗受到的鹽脅迫；F-11可以顯著增加玉米幼苗的莖長(zhǎng)和根長(zhǎng)，最多增加一倍，F(xiàn)-9和F-58可以分別增加玉米鮮重45%和42%［7］。因此，利用根際促生菌可以減緩農(nóng)作物受到的脅迫，為微生物開辟了一個(gè)新興的利用途徑。

本實(shí)驗(yàn)用10%的鹽濃度培養(yǎng)基從玉米根際土壤篩選耐鹽促生菌并驗(yàn)證其促生性。通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)，用不同的方式處理玉米幼苗，測(cè)定幼苗生長(zhǎng)及生理指標(biāo)。探究耐鹽促生菌提高玉米幼苗的耐鹽性以及促進(jìn)玉米幼苗生長(zhǎng)的機(jī)制，以期獲得在鹽漬化土壤中能夠促進(jìn)玉米生長(zhǎng)的根際耐鹽促生菌，促進(jìn)玉米在鹽漬化土壤中的生長(zhǎng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品的收集 土壤樣品來(lái)自于天津大學(xué)試驗(yàn)田種植的玉米根際土壤，將玉米連根拔起，輕輕抖動(dòng)去除非根際土，用無(wú)菌水將玉米根際土沖下并收集，4℃保存待用［8］。

1.1.2 培養(yǎng)基 基礎(chǔ) LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，酵母提取物10.0 g，NaCl 10.0 g，用ddH2O溶解并定容至1 L。基礎(chǔ)LB固體培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)LB液體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉15.0 g。無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖 10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，NaCl 0.3 g，Ca3（PO4）210.0 g， 瓊脂 15.0 g，用ddH2O 溶解并定容至1 L，pH值7.0-7.5。有機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖 10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，NaCl 0.3 g，CaCO35.0 g，卵磷脂 0.2 g，瓊脂 15.0 g，ddH2O 1 L，pH 值 7.0-7.5［9］。

1.1.3 供試玉米種子 本實(shí)驗(yàn)室保存的兩種不同品系的玉米種子，分別為優(yōu)良玉米自交系1666和7922，分別記作品系1和品系2。

1.2 方法

1.2.1 根際耐鹽促生菌的分離 稱取玉米根際土壤樣品5 g（濕重），放入已滅菌的裝有100 mL無(wú)菌水的250 mL錐形瓶中，置于搖床，震蕩培養(yǎng)20 min（30℃、160 r/min）。吸取1 mL上清液放入已滅菌的試管中，加入9 mL無(wú)菌水稀釋。用接種環(huán)蘸取上述稀釋液，并分別在鹽濃度為5%、6%、7%、8%、9%和10%的LB固體平板上進(jìn)行劃線。將上述平板置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。選取不同鹽濃度下LB平板中具有相同形態(tài)的菌落作為初選耐鹽促生菌落，挑取鹽濃度為10%固體LB平板中的初選耐鹽菌落接種到鹽濃度為10%的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃進(jìn)行富集培養(yǎng)24 h。將富集菌液稀釋100倍，用接種環(huán)蘸取稀釋液并接種于鹽濃度為10%的LB固體培養(yǎng)基中，進(jìn)行劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。取上述長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以上實(shí)驗(yàn)操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.2.2 根際耐鹽促生菌的生理生化及分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第8版）和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)根際耐鹽促生菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定［10-11］。

采用SDS-CTAB法提取耐鹽促生菌總DNA［12］。以提取的總DNA為模板，用細(xì)菌通用引物27F，5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R，5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'進(jìn) 行PCR擴(kuò) 增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至金唯智公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN進(jìn)行拼接，將拼接好的序列去掉兩端引物后，提交EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中的Identify程序（https：//www.ezbiocloud.net/identify）進(jìn)行比對(duì)，找出與所測(cè)菌株序列同源性較高的模式菌株類型，下載該菌株的16S rDNA序列，利用MEGA6.0中的Neighbor-joining analysis構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 根際耐鹽促生菌溶磷特性的測(cè)定 將根際耐鹽促生菌接種在無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)5 d后觀察。

1.2.4 盆栽實(shí)驗(yàn) 用無(wú)菌水將種子浸泡24 h。將保存的菌種在基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，并在搖床中培養(yǎng)至OD600值為0.6-0.8，離心，去上清，將沉淀菌體用無(wú)菌水重懸，即得到處理種子的菌液。營(yíng)養(yǎng)土和蛭石配比為1∶1，121℃滅菌1 h。盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在托盤中放入蛭石，將預(yù)處理的種子進(jìn)行萌發(fā)，待幼苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽至花盆中，每盆移2株，移栽時(shí)記錄幼苗的根長(zhǎng)和株高，并把幼苗移栽至相同高度。4種處理組合如下：空白對(duì)照組：不加菌，不加鹽，記作CK組。加菌組：加菌，不加鹽，記作CB組。加鹽組：不加菌，加鹽，記作CS組。加菌加鹽組：加菌，加鹽，記作CBS組。其中：加菌方式為根灌方式，每次在根際周圍澆1 mL的處理種子菌液，每隔2 d澆一次；不加鹽方式為植株澆無(wú)菌水，加鹽方式為植株澆150 mmol/L的無(wú)菌鹽溶液。每種組合3次重復(fù)，室溫培養(yǎng)，每個(gè)托盤每次澆1.5 L的水或鹽溶液，每隔3 d澆一次水，室溫培養(yǎng)15 d后，分別進(jìn)行生長(zhǎng)生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.5 玉米幼苗生長(zhǎng)生理指標(biāo)的測(cè)定

1.2.5.1 株高和根長(zhǎng)變化量的測(cè)定 測(cè)量移栽前和移栽后培養(yǎng)15 d后的株高和根長(zhǎng)，并計(jì)算株高和根長(zhǎng)變化量。

1.2.5.2 葉綠素含量的測(cè)定 取0.1 g新鮮葉片置于10 mL離心管中，加入5 mL 95%的乙醇，黑暗浸提48 h，直至葉片完全變白為準(zhǔn)［13］。

1.2.5.3 抗氧化酶活性的測(cè)定 采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性［14］，采用NBT還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性［15］，利用 Aebi［16］的方法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性。

1.2.5.4 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定 采用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定玉米新鮮葉片MDA的含量［17］。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 利用軟件SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，利用OriginPro 9.0進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果

2.1 植物耐鹽促生菌的生理生化及16S rDNA分子學(xué)鑒定

經(jīng)過(guò)鹽濃度為10% LB培養(yǎng)基的篩選，從玉米根際土壤中篩選出一株根際耐鹽促生菌Y1，革蘭氏陽(yáng)性菌，生理生化特征如表1所示。

表1 嗜根考克氏菌Y1的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

篩選的根際耐鹽促生菌的16S rDNA基因的PCR目的條帶大小為1 500 bp左右（圖1）。

圖1 篩選菌株16S rDNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)根際耐鹽促生菌的16S rDNA的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，利用DNAMAN進(jìn)行拼接后顯示其基因序列為1 360 bp，利用數(shù)據(jù)庫(kù)EzBioCloud中的Identify功能，對(duì)基因序列進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果顯示測(cè)得的基因序列與模式菌株Kocuria rhizophila DSM 11926（T）的16S rDNA序列有100%的相似性，利用MAGA6.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，構(gòu)建出如圖2的系統(tǒng)發(fā)育樹，Y1代表篩選的根際耐鹽促生菌，由系統(tǒng)發(fā)育樹可知Y1與Kocuria rhizophila DSM 11926（T）同屬于一個(gè)分支，并具有100%的同源性，結(jié)合形態(tài)特征及生理生化實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為篩選的這株根際耐鹽促生菌為嗜根考克氏菌。

圖2 根際耐鹽促生菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 根際耐鹽促生菌的溶磷特性

無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基和有機(jī)磷培養(yǎng)基上均出現(xiàn)透明圈，表明根際耐鹽促生菌能夠溶解無(wú)機(jī)態(tài)和有機(jī)態(tài)的磷，并把兩者從無(wú)效態(tài)轉(zhuǎn)變成可供自身或植物所吸收的有效態(tài)的磷，從而證明此菌具有溶磷的特性。

2.3 根際耐鹽促生菌對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)影響

2.3.1 對(duì)植株株高、根長(zhǎng)的影響 玉米生長(zhǎng)情況如圖3-4所示，CB組的玉米植株的長(zhǎng)勢(shì)明顯比CK組玉米好，而CS組的生長(zhǎng)狀況明顯比CK組差，并表現(xiàn)出萎蔫的癥狀，品系2玉米的癥狀更加明顯。而在加鹽情況下，接菌組與未接菌組相比，萎蔫程度前者明顯好于后者。說(shuō)明接種根際耐鹽促生菌能夠促進(jìn)玉米植株的生長(zhǎng)，同時(shí)，能緩解鹽脅迫對(duì)玉米生長(zhǎng)造成的危害。如圖5和6所示，CB組的兩種品系玉米幼苗株高和根長(zhǎng)變化量比CK組顯著增加，分別增加了44.96%和49.45%左右；CBS組的兩種品系玉米的株高和根長(zhǎng)也顯著高于CS組，分別增加了1.2倍和1.17倍；與CK組相比，CS組的兩種玉米品系的株高和根長(zhǎng)指標(biāo)顯著下降。綜合分析表明，鹽脅迫下，

圖3 品系1玉米在四種處理方式下的生長(zhǎng)情況

圖4 品系2玉米在四種處理方式下的生長(zhǎng)情況

玉米幼苗的生長(zhǎng)受到抑制，但將Y1菌定殖在玉米根際可以緩解鹽脅迫；在沒(méi)有鹽脅迫下，將Y1菌定殖在玉米根際也能促進(jìn)玉米幼苗生長(zhǎng)。

2.3.2 對(duì)玉米葉片葉綠素的影響 如圖7所示，CB組兩種品系玉米幼苗的總?cè)~綠素含量比CK組提高了74.44%左右；CBS組的總?cè)~綠素含量比CS組提高了56.24%左右；而與CK組相比，CS組兩種品系玉米幼苗的總?cè)~綠素含量則顯著降低。以上結(jié)果表明，在鹽脅迫下，玉米幼苗鮮葉上的葉綠素合成受到抑制，影響幼苗光合作用；定殖Y1菌可以使葉綠素維持在較高的水平，從而降低鹽脅迫對(duì)光合作用的影響。在沒(méi)有鹽脅迫下，定殖Y1菌可以增加玉米幼苗葉綠素的合成，促進(jìn)幼苗葉片光合作用。

圖5 不同處理對(duì)兩種品系玉米株高變化的影響

圖6 不同處理對(duì)兩種品系玉米根長(zhǎng)變化的影響

圖7 不同處理方式下玉米葉片總?cè)~綠素含量

2.3.3 對(duì)植株抗氧化酶活性的影響 如圖8、9、10所示，CB組兩種品系玉米幼苗葉片的CAT、POD和SOD活性與CK組相比顯著下降，但差異性較小，這表明在沒(méi)有鹽脅迫下，定殖Y1菌反而使3種抗氧化酶活性降低。CBS組幼苗葉片的CAT活性顯著大于CS組，品系1和品系2分別提高了1.18倍和0.61倍；而POD和SOD活性卻顯著低于CS組。CS組幼苗葉片的3種酶活都顯著高于CK組，這表明在鹽脅迫下，葉片會(huì)提高自身抗氧化酶活性來(lái)抵御鹽脅迫。

圖8 不同處理下玉米葉片CAT酶的活性

圖9 不同處理下玉米葉片SOD活性的測(cè)定

圖10 不同處理下玉米葉片POD活性的測(cè)定

2.3.4 對(duì)植株MDA含量的影響 如圖11所示，CB組兩種品系玉米幼苗葉片MDA含量顯著低于CK組，CK組的MDA含量是CB組含量的3.24倍左右，這表明在沒(méi)有鹽脅迫下，定殖Y1菌使葉片中MDA含量降低。CBS組幼苗葉片MDA含量顯著低于CS組，CS組MDA含量是CBS組的3.08倍左右。這表明在鹽脅迫下，定殖Y1菌使得葉片中MDA含量降低。與CK組相比，CS組幼苗葉片MDA含量顯著增加，這表明鹽脅迫下會(huì)增加葉片MDA含量。

圖11 不同處理下玉米葉片MDA的含量

3 討論

土壤鹽漬化會(huì)抑制農(nóng)作物生長(zhǎng)，進(jìn)而降低農(nóng)作物產(chǎn)量，是農(nóng)業(yè)面臨的一個(gè)重大難題［18］。為了降低高鹽對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)造成的毒害，利用耐鹽促生菌來(lái)緩解鹽對(duì)農(nóng)作物的脅迫在近些年已得到發(fā)展。本研究以高鹽作為條件，篩選出一株耐鹽菌Y1，經(jīng)鑒定為嗜根考克氏菌。目前，已知的分離自根際的嗜根考克氏菌的主要功能在于耐鹽、分解有機(jī)污染物。Abhilash等［19］從植物根際分離出了嗜根考克氏菌，將其用于分解新型持續(xù)性有機(jī)污染物林丹，結(jié)果顯示在中低濃度的林丹土壤中，嗜根考克氏菌能夠分解林丹。全基因組測(cè)序表明，嗜根考克氏菌DNA中存在過(guò)氧化氫酶、烷基氫過(guò)氧化物還原酶，DyP型過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶等多種抗氧化酶基因以及與植物相關(guān)的III型PKS基因［20-21］，植物III型聚酮合成酶在植物次生代謝產(chǎn)物生物合成中起著非常重要的作用［22］，因此這可以作為嗜根考克氏菌能作為根際促生菌的可能證據(jù)之一。同時(shí)本研究驗(yàn)證嗜根考克氏菌具有高效溶磷的特性，這進(jìn)一步證實(shí)了此菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的可能。

研究表明，從不同脅迫環(huán)境中分離的根際菌對(duì)不同脅迫均具有耐受性，同時(shí)也具有促生作用，將這些根際菌定殖在植物根際可以增加植物的根長(zhǎng)、株高、生物量、葉綠素含量、類胡蘿卜素含量以及可溶性蛋白含量［23］。本實(shí)驗(yàn)中，CBS組的株高和根長(zhǎng)變化量和葉綠素都顯著高于CS組，這進(jìn)一步證實(shí)了Tiwari等的研究。但是CBS組上述指標(biāo)顯著低于CB組，這表明在鹽脅迫下，耐鹽根際促生菌雖未完全解除鹽對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響，但是在一定程度上緩解了鹽對(duì)玉米植株生長(zhǎng)帶來(lái)的抑制作用。趙清［24］認(rèn)為當(dāng)植物受到鹽脅迫時(shí)，體內(nèi)的抗氧化酶活性顯著增強(qiáng)，進(jìn)而提高植物的抗氧代謝水平，降低因鹽脅迫帶來(lái)的植物細(xì)胞器功能的損傷。本實(shí)驗(yàn)中，CS組幼苗葉片的3種抗氧化酶活性比CK組顯著增高，這與趙清的研究結(jié)果一致。雖然CS組幼苗葉片中的葉綠素含量較CK組有顯著的降低，這可能是由于抗氧化酶并沒(méi)有完全清除鹽脅迫帶來(lái)的損害，對(duì)幼苗葉片葉綠體造成一定的損傷。CBS組中POD和SOD活性卻比CS組顯著降低，這與潘晶等［25］的觀點(diǎn)不一致。這可能是由于植物在受到鹽脅迫后除了激活抗氧化系統(tǒng)，還可以通過(guò)非酶促系統(tǒng)如植物自身會(huì)產(chǎn)生為類胡蘿卜素、抗壞血酸、谷胱甘肽、類黃酮、生育酚等物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓抵御鹽脅迫［26］。無(wú)論是否有鹽脅迫，在玉米幼苗根際定殖Y1菌都會(huì)降低玉米葉片MDA含量，這表明Y1菌可以通過(guò)降低葉片MDA含量來(lái)減緩鹽脅迫的毒害。綜上所述，嗜根考克氏菌可以作為根際促生菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)，這對(duì)提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。

4 結(jié)論

在高鹽條件下，從玉米根際土壤中分離出的Y1菌，經(jīng)生理生化和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定為嗜根考克氏菌，該菌具有溶磷特性。利用該菌進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)，用不同方式處理玉米幼苗，15 d后測(cè)定玉米幼苗生長(zhǎng)生理指標(biāo)。經(jīng)測(cè)定得出，在沒(méi)有鹽脅迫下，將嗜根考克氏菌定殖在玉米幼苗根際上，該菌可以通過(guò)提高葉片中葉綠素含量以及降低葉片中的MDA含量來(lái)增加株高和根長(zhǎng)的變化量，從而促進(jìn)玉米幼苗的生長(zhǎng)；在鹽脅迫下，該菌可以通過(guò)提高葉片中葉綠素含量、CAT活性以及降低葉片中的MDA含量來(lái)增加株高和根長(zhǎng)的變化量，從而緩解鹽對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的抑制，促進(jìn)玉米幼苗的生長(zhǎng)。