一株煙草青枯拮抗細(xì)菌中活性物質(zhì)穩(wěn)定性和粗提物成分分析

吳 翔，謝麗源，甘炳成*，陳 影，彭衛(wèi)紅，譚 昊，黃忠乾

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2. 農(nóng)業(yè)部西南區(qū)域農(nóng)業(yè)微生物資源利用科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，四川 成都 610066；3.農(nóng)業(yè)部西南山地農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066)

【研究意義】微生物代謝產(chǎn)生活性物質(zhì)的提取、純化一般要經(jīng)過(guò)離心、濃縮、萃取、鑒定等繁瑣的程序，它是包括微生物學(xué)、分析化學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科交叉的綜合研究技術(shù)，技術(shù)難度大。更由于微生物代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)的成分是未知的，在不斷的提取、純化過(guò)程中要通過(guò)活性物質(zhì)的檢測(cè)來(lái)確定所提取和純化的物質(zhì)是否存在活性成分，更加大了該類實(shí)驗(yàn)研究的難度?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】因此，目前很多關(guān)于微生物代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)的研究是關(guān)于成分的推斷和粗提物的性質(zhì)方面的研究。煙草病害微生物防治研究中針對(duì)活性物質(zhì)的研究不多[1-2]，關(guān)于煙草青枯病拮抗菌的活性物質(zhì)研究報(bào)道更少，已有的報(bào)道主要包括對(duì)活性物質(zhì)分子量大小分析和主要成分分析?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究前期篩選獲得1株對(duì)煙草青枯病原菌具有良好拮抗效果的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)MT-002-B-7，為了初步了解抑菌物質(zhì)的基本性質(zhì)和所含的可能大致成分，對(duì)其抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行了研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在探索拮抗活性物質(zhì)成分方面，紅外光譜分析法和GC-MS分析法是常用到的方法，本研究參照目前已有的研究方法，通過(guò)對(duì)煙草青枯拮抗菌的活性物質(zhì)進(jìn)行離心、濃縮和萃取，主要研究了拮抗菌MT-002-B-7發(fā)酵液活性提取物質(zhì)的基本性質(zhì)，并結(jié)合紅外光譜和GC-MS的檢測(cè)結(jié)果分析和推測(cè)其中活性可能成分，探索拮抗菌株的拮抗機(jī)理，為多功能生物有機(jī)肥的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 從高粱根際土中篩選獲得的對(duì)煙草青枯病原菌具有較好拮抗效果的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)MT-002-B-7，該菌為革蘭氏陰性的好氧細(xì)菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 10.0 g，pH 7.4。

TM培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，葡萄糖 5.0 g，酪素水解物 1.0 g，瓊脂粉 18.0 g。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 將MT-002-B-7接入LB培養(yǎng)液中，28 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)時(shí)間24 h即得到發(fā)酵好的菌液。

1.2.2 抑菌活性檢測(cè)方法 將煙草青枯病原菌在TM培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)。用直徑為6 mm的打孔器在空白TM培養(yǎng)皿中央打1個(gè)孔，再在離平板中心距離相等的3個(gè)方向分別打孔。從培養(yǎng)好的病原菌平皿中打孔出同樣大小菌餅置于空白培養(yǎng)基的中央孔中，四周孔注入30 μl待測(cè)粗提液，于28 ℃正置培養(yǎng)，觀測(cè)其抑菌情況。

1.2.3 粗提取發(fā)酵液活性產(chǎn)物 將MT-002-B-7發(fā)酵液6000 r/min離心10 min，取上清液用乙醚、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮以1∶1比例萃取，分別萃取3次，減壓濃縮測(cè)定不同有機(jī)相和水相的抑菌活性，以對(duì)應(yīng)有機(jī)溶劑作為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 拮抗粗提液穩(wěn)定性測(cè)定[2-3]① 拮抗粗提液的熱穩(wěn)定性。將拮抗粗提液分別在30、40、50、60、70、80、90、100 ℃的水浴中加熱30 min，在115、121 ℃的高壓鍋中加熱20 min，以未加熱處理的樣品為對(duì)照，檢測(cè)各處理液的抑菌活性。② 拮抗粗提液對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性。將拮抗粗提液分別用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K在55 ℃處理3 h，酶反應(yīng)濃度為1 mg/mL，以未用酶處理的為對(duì)照，檢測(cè)各處理液的抑菌活性。③ 拮抗粗提液對(duì)紫外線的穩(wěn)定性。將拮抗粗提液置于8 W紫外光下，距離20 cm，分別照射1、2、4、6、8、10和24 h，以未用紫外光照射為對(duì)照，檢測(cè)各處理液的抑菌活性。④ 拮抗粗提液活性的有效時(shí)間。把拮抗粗提液在室溫條件下(25 ℃左右)放置30 d，分別在第3、5、7、10、15、20和30天取樣，以剛提取的拮抗粗提物的活性為對(duì)照，檢測(cè)各處理的抑菌活性。⑤ 拮抗粗提液的酸堿穩(wěn)定性。拮抗粗提液用HCl或NaOH分別調(diào)為pH值1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0和14.0 共14個(gè)梯度，靜置過(guò)夜，再分別調(diào)pH值至中性，以未處理粗提物為對(duì)照，檢測(cè)各處理的抑菌活性。

1.2.5 粗提物的制備 將發(fā)酵液6000 r/min離心10 min，收集上清液，將上清液和乙酸乙酯1∶1比例萃取，收集有機(jī)相，并將有機(jī)相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，濃縮物放置于-20 ℃冰箱預(yù)凍過(guò)夜，最后用冷凍干燥機(jī)冷凍得到拮抗物質(zhì)干品，備用于后續(xù)試驗(yàn)。菌株MT-002-B-7經(jīng)冷凍干燥后的拮抗物質(zhì)呈黃白色粉末狀，結(jié)塊處是淡黃色，如圖1所示。

1.2.6 粗提物成分分析 ① 紅外光譜掃描。將拮抗提取物與干燥的KBr研磨混勻，壓片，所制片送往中國(guó)科學(xué)院成都分院分析測(cè)試中心用紅外光譜儀在4000～500 cm-1區(qū)間掃描。②氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定化學(xué)成分，將拮抗提取凍干產(chǎn)物送往青島科標(biāo)化工分析檢測(cè)有限公司，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)其成分進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)條件如下：取少量樣品用水溶解，再取少量溶液滴加到乙酸乙酯和丙酮1∶1的混合溶液中，混勻、過(guò)濾、上機(jī)。

圖1 冷凍干燥后的拮抗物質(zhì)Fig.1 Freeze-dried antibiotics production

表1 溶劑萃取成分抑菌活性比較

注：“-”表示無(wú)抑菌圈，“NA”表示不溶。

Note: ‘-’ means no inhibitory zone ;‘NA’ means not applicable.

用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，TG-5 MS型色譜柱的升溫速率為：初始柱溫60 ℃，保持5 min，以3.5 ℃/min升溫到100 ℃，保持5 min，以8 ℃/min升溫到200 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升溫到280 ℃，保持15 min。以不接菌培養(yǎng)液作為對(duì)照，分別測(cè)定化學(xué)物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性代謝產(chǎn)物萃取溶劑的研究

選取乙醚、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行萃取，分別測(cè)定其水相和有機(jī)相抑菌活性，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，表中的數(shù)據(jù)表明各提取相的抑菌圈大小。用丙酮進(jìn)行萃取時(shí)，出現(xiàn)乳化現(xiàn)象無(wú)法分層，因此不能檢測(cè)其萃取后的結(jié)果。而活性物質(zhì)在氯仿、乙醚、正丁醇等萃取液中沒(méi)有抑菌活性，說(shuō)明該物質(zhì)不溶于此類有機(jī)溶劑，而溶于乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。根據(jù)相似相溶原理，該物質(zhì)能被乙酸乙酯萃取，證明活性物質(zhì)的極性與乙酸乙酯更為接近，因此選用乙酸乙酯作為發(fā)酵上清液的萃取溶劑。

2.2 拮抗粗提液穩(wěn)定性

2.2.1 熱穩(wěn)定性 粗提液在經(jīng)過(guò)30～121 ℃不同溫度階段處理后，檢測(cè)其抑菌活性，對(duì)照測(cè)得抑菌圈大小為34.11 mm，結(jié)果如圖2所示。粗提液在30～90 ℃溫度區(qū)間基本能保持抑菌活性穩(wěn)定，活性同對(duì)照相比相差不大，沒(méi)有達(dá)到顯著性差異(P>0.05)。但在90 ℃水浴處理后其活性開(kāi)始有所下降，之后隨著處理溫度的升高活性逐漸下降，100、115和121 ℃處理后較對(duì)照分別下降3.66 %、7.48 %和8.74 %，由此可以看出高于100 ℃，隨著溫度升高，活性略有降低。由此得知，拮抗活性物質(zhì)具有一定的熱穩(wěn)定性。

圖2 拮抗提取物的熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermostability of extractive

圖3 不同蛋白酶對(duì)拮抗提取物抑菌活性的影響Fig.3 Effects of different protease on activity of crude extract

2.2.2 對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性 用3種不同蛋白酶處理粗提液，以不處理為對(duì)照，對(duì)照抑菌圈大小為34.11 mm，檢測(cè)其對(duì)煙草青枯病原菌的抑制效果，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶處理后的蛋白酶處理液抑菌圈與對(duì)照相比相差不大，沒(méi)有達(dá)到顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明粗提液抑菌活性對(duì)蛋白酶不敏感。由此推測(cè)，拮抗物質(zhì)中可能不含有蛋白質(zhì)成分。

2.2.3 對(duì)紫外線的穩(wěn)定性 粗提液經(jīng)過(guò)紫外線照射后，隨著照射時(shí)間的增加，抑菌活性逐漸降低，如圖4所示。紫外照射1、2、4和6 h的抑菌活性與對(duì)照34.11 mm的抑菌圈相比沒(méi)有達(dá)到顯著性差異(P>0.05)，當(dāng)照射8 h，抑菌活性顯著降低(P<0.05)，抑菌活性為對(duì)照的79.7 %，當(dāng)照射24 h時(shí)，抑菌活性極顯著低于對(duì)照(P<0.01)，抑菌活性僅為對(duì)照的64.3 %。研究結(jié)果表明，紫外照射時(shí)間低于6 h對(duì)拮抗物質(zhì)抑菌活性沒(méi)有明顯影響，而照射時(shí)間超過(guò)6 h，拮抗物質(zhì)的抑菌活性顯著下降，直到10 h后變化不大。

圖4 紫外線照射對(duì)拮抗提取物抑菌活性的影響Fig.4 Effects of ultraviolet radiation on activity of crude extract

圖5 保存時(shí)間對(duì)拮抗提取物抑菌活性的影響Fig.5 Effects of store time on activity of crude extract

2.2.4 拮抗物質(zhì)活性的有效時(shí)間 拮抗物質(zhì)活性隨時(shí)間的保持能力對(duì)該類物質(zhì)的應(yīng)用開(kāi)發(fā)非常重要，是考察其應(yīng)用潛力的重要指標(biāo)。在放置拮抗物質(zhì)的30 d中，檢測(cè)了的7次拮抗提取物質(zhì)樣品抑菌活性，結(jié)果如圖5所示。不同時(shí)間段的檢測(cè)抑菌活性與對(duì)照相比沒(méi)有達(dá)到顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明拮抗物質(zhì)的抑菌活性并沒(méi)有因?yàn)榉胖脮r(shí)間的延長(zhǎng)而降低。

2.2.5 酸堿穩(wěn)定性 實(shí)驗(yàn)未經(jīng)處理粗提物的抑菌圈大小為32.67 mm。如圖6所示，pH值對(duì)粗提液的抑菌活性影響很大，在試驗(yàn)的不同pH值范圍，抑菌圈直徑處于3個(gè)主要的階段。當(dāng)pH 1～4抑菌活性較低，且不同pH間抑菌活性相差不大(P>0.05)；pH 5～7具有較高的抑菌活性，活性相當(dāng)于對(duì)照的88.5 %～91.4 %，但當(dāng)pH調(diào)整至8之后，抑菌活性急劇下降，極顯著(P<0.01)低于pH 5～7時(shí)粗提液抑菌活性。由此可見(jiàn)，粗提液在微酸至中性條件下具有較好地抑菌活性，偏酸或偏堿都不能很好地維持粗提液的抑菌活性。盡管經(jīng)過(guò)pH 1和pH 14處理，檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明粗提液的抑菌活性仍然存在，說(shuō)明拮抗物質(zhì)具有較廣的pH耐受能力。

2.3 粗提物活性成分分析

2.3.1 紅外光譜掃描分析 參考胡皆漢等人編寫的《實(shí)用紅外光譜學(xué)》對(duì)圖譜進(jìn)行分析[4]，從圖7可以看出，在3430.0、2962.1、1639.5、1455.7、1407.8、1331.6、1246.2、1080.3、1038.2 cm-1有吸收峰，其中在其特征頻率區(qū)波數(shù)1639.5、2962.1 cm-1表示分子中可能含有羧基和α，β-不飽和內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，3430.0 cm-1可能是O-H伸縮振動(dòng)峰，1038.2 cm-1可能是C-H苯環(huán)1、3、5取代峰，1331.6、1246.2 cm-1可能是C=O伸縮振動(dòng)峰(也可能是C=C振動(dòng)峰)，1455.7和1407.8 cm-1可能是C=H面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰，919.9 cm-1可能是-CH2面外變形振動(dòng)峰，875.5 cm-1可能是=C-H振動(dòng)峰，840.8 cm-1可能是-C-H面外變形振動(dòng)峰。

圖6 拮抗提取物的酸堿穩(wěn)定性Fig.6 The stability of extractive on different pH

圖7 拮抗物質(zhì)紅外吸收光譜Fig.7 IR spectrum of the antibiotics production

2.3.2 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)拮抗物質(zhì)成分 由圖8分析可知，樣品中含有脂肪酸、斑蝥素、5-乙?；臍溥秽?2-酮、3-甲基-6-異丙基-2,5-哌嗪二酮、環(huán)(甘氨?；涟彼?、N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、脯氨酸環(huán)二肽、3,6-二(甲基丙基)-2,5-哌嗪二酮、吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、酚嗪等成分。

在培養(yǎng)基中檢測(cè)出的多種物質(zhì)中，與樣品中具有相同類別的成分為六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、3,6-二(甲基丙基)-2,5-哌嗪二酮和吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，并且前兩者含量和樣品中的相差不大，因此判斷樣品中的這兩種物質(zhì)由于不被菌株生長(zhǎng)所轉(zhuǎn)化，在樣品中繼續(xù)檢出，是培養(yǎng)基中所含有而非菌株生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物；樣品中檢出的吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和脯氨酸環(huán)二肽的含量低于培養(yǎng)基中，判斷是菌株生長(zhǎng)中部分轉(zhuǎn)化利用了該物質(zhì)，檢出的為剩余部分，因此該物質(zhì)也非菌株生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物；培養(yǎng)基中檢出的、但沒(méi)有在樣品中檢測(cè)出的其它類物質(zhì)推斷為被菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中轉(zhuǎn)化利用了，培養(yǎng)基和樣品中各檢出成分及含量如表2所示。

綜上所述，GC-MS掃描分析揭示出樣品所含的成分為脂肪酸、斑蝥素、5-乙?；臍溥秽?2-酮、3-甲基-6-異丙基-2,5-哌嗪二酮、環(huán)(甘氨?；涟彼?、N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、酚嗪等成分。其中含量最高的前3類物質(zhì)為: 11.99 %的N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、6.02 %脂肪酸和3.69 %的酚嗪，其它幾類物質(zhì)的含量相對(duì)較低。

圖8 GC-MS檢測(cè)培養(yǎng)基(a)和樣品(b)中的成分Fig.8 Components of control and sample on GC-MS

3 討 論

分析結(jié)果表明，拮抗物質(zhì)不能被供試的多數(shù)有機(jī)溶劑萃取，只有乙酸乙酯能部分萃取出活性成分。已有的研究報(bào)道說(shuō)明，乙酸乙酯可作為多種植物的病原拮抗菌活性成分的萃取有機(jī)溶劑[5-7]，說(shuō)明多種植物的病原拮抗菌活性成分具有和乙酸乙酯相似的極性。

菌株MT-002-B-7的粗提液抑菌活性對(duì)蛋白酶不敏感，由此推斷粗提物中可能不含有蛋白質(zhì)成分。通過(guò)紅外光譜和GC-MS成分掃描分析可知，拮抗物質(zhì)中可能含有脂肪酸、斑蝥素、5-乙?；臍溥秽?2-酮、3-甲基-6-異丙基-2,5-哌嗪二酮、環(huán)(甘氨?；涟彼?、N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、酚嗪等成分。其中紅外光譜圖中1639.5 cm-1是仲胺類NH彎(面內(nèi))彎曲振動(dòng)峰，是脯氨酸環(huán)二肽或者甘氨?；涟彼岬奶卣鞣?，1331、1246、1080.3、1038.2 cm-1是叔胺類C-N振動(dòng)峰(1350～1020 cm-1)；1639.5 cm-1應(yīng)該是1-酮基-2羥基(或氨基)芳酮，是N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮雜雙環(huán)[4，3，0]-壬烷-2,5-二酮的特征峰；1407.8 cm-1為羥基面內(nèi)彎曲振動(dòng)的峰(1440～1375 cm-1)，是脂肪酸的特征峰；1246.2 cm-1為結(jié)晶性長(zhǎng)鏈脂肪酸固相特征峰。因此，進(jìn)一步結(jié)合GC-MS掃描成分含量比例，認(rèn)為拮抗物質(zhì)主要為N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、脂肪酸和酚嗪。陳亮等的研究結(jié)果表明，抑制煙草青枯病的活性成分主要為環(huán)二肽-(酪氨酸-亮氨酸)[8]，該成分與本研究分析所得的環(huán)(甘氨?；涟彼?具有相似的結(jié)構(gòu)模式，都具有2個(gè)氨基酸組成的環(huán)二肽。而其它關(guān)于煙草青枯病拮抗菌中活性成分分析的研究報(bào)道較少，易有金[9]張秀玉[10]測(cè)出拮抗物質(zhì)的大概分子量，董昆明的研究結(jié)果表明拮抗煙草青枯病原菌的活性成分是由13種不同的化合物組成的混合物，但未確定13種化合物成分[11]。

表2 通過(guò)GC-MS檢測(cè)出的培養(yǎng)基和樣品中所含的物質(zhì)

但本研究中由于乙酸乙酯不能完全萃取吸附發(fā)酵液的活性物質(zhì)，可能導(dǎo)致紅外光譜和GC-MS檢測(cè)出的物質(zhì)有遺漏。另外GC-MS分析時(shí)，粗提物中是否所有的活性物質(zhì)都被氣化檢出，其中被檢出的各種物質(zhì)是否能單獨(dú)或協(xié)同抑制煙草青枯病原菌都有待更多的研究來(lái)分析和驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

(1)結(jié)果表明菌株MT-002-B-7的拮抗活性物質(zhì)和乙酸乙酯的極性相似，具有一定的熱穩(wěn)定性，對(duì)蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感，抑菌活性不受保存時(shí)間的影響。但當(dāng)8w紫外線照射的時(shí)間超過(guò)8 h，pH<5和pH>8的條件會(huì)顯著降低粗提物的抑菌活性。

(2)結(jié)合分析紅外光譜結(jié)果和GC-MS檢測(cè)結(jié)果，初步認(rèn)為拮抗物質(zhì)中主要的成分是N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、脂肪酸、酚嗪、斑蝥素、5-乙酰基四氫呋喃-2-酮、3-甲基-6-異丙基-2,5-哌嗪二酮、環(huán)(甘氨?；涟彼?等成分，其中前3種含量最高，分別是11.99 %、6.02 %和3.69 %，其它幾類物質(zhì)的含量相對(duì)較小。