圈養(yǎng)不同性別林麝糞便菌群多樣性研究

趙貴軍，竭 航，朱吉彬，鄭程莉，曾德軍，張承露，戚文華，封孝蘭*

(1. 重慶市藥物種植研究所，重慶 南川 408435；2. 四川養(yǎng)麝研究所，四川 成都 610016；3. 重慶三峽學(xué)院，重慶 萬州 404000)

【研究意義】林麝 (MoschusberezovskiiFlerov)俗稱獐子，是我國6種麝科動物中種群數(shù)量最多的一種。成年雄麝的香囊腺分泌物——麝香，不僅有較高的藥用價值，還是一種名貴的天然高級香料。林麝為國家Ⅰ級重點保護野生動物，《世界自然保護聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》將林麝列為瀕危物種[1-3]。從20 世紀(jì)60年代起我國便開始進行人工林麝養(yǎng)殖，但因環(huán)境惡化、疾病等因素規(guī)模仍舊難以擴大[4-5]。此外野生林麝自由采食多種植物的枝葉、果實和種子，一般不存在營養(yǎng)缺乏情況，但在人工飼養(yǎng)條件下，目前沒有專門為林麝配制的全價飼料。青綠飼料品種單一，造成林麝腸道對營養(yǎng)吸收不全面，體質(zhì)差，易患病[6]。隨著微生態(tài)制劑的發(fā)展，利用有益菌去改善飼料配方，可提高林麝抗病性能[7-8]?！厩叭搜芯窟M展】健康宿主的腸道微生物為宿主提供營養(yǎng)和能量，有利于新陳代謝和免疫系統(tǒng)保持平衡。患病宿主的腸道微生物會引發(fā)系列炎癥和增加導(dǎo)致疾病[9]。腸道微生物組成受到很多因素的影響，例如食性、健康狀態(tài)、年齡、地理環(huán)境等。但對于不同性別健康林麝的腸道微生物的組成區(qū)別，對疾病抵抗力的差異，研究報道還較少?！颈狙芯壳腥朦c】本研究擬通過性別差異下腸道微生物的組成特征，來反映不同性別差異下林麝的抗病能力，特別是揭示雄性林麝染病死亡率高的原因?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用Illumina MiSeq測序技術(shù)，通過對不同性別的林麝糞便微生物組成的比較分析及腸道微生物功能的探究，了解不同性別下腸道微生物的差異對抗病性能及繁殖性能的影響。同時，揭示林麝的腸道微生物群落特征，為后續(xù)深入研究林麝的腸道消化吸收、疾病防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物為來自圈養(yǎng)于重慶市藥物種植研究所的林麝，林麝飼糧以青綠飼料和精細(xì)飼料搭配飼喂。自由采食青綠飼料以紅薯(Ipomoeabatatas)藤和光葉海桐(Pittosporumglabratum)嫩葉為主。精細(xì)飼料成分為玉米、大豆、小麥麩、菜籽餅和魚粉，并添加磷酸氫鈣、磷酸類、磷酸氫鈣和食鹽(表1)。試驗共分2個處理組，分別為10只健康雄性林麝和10只健康雌性林麝，采集各林麝新鮮糞便5 g，用無菌聚乙烯自封袋裝好錫箔紙包裹，快速置于液氮罐中帶回實驗室，然后于-80 ℃超低溫冰箱中凍存以備DNA提取所用。

表1 林麝精細(xì)飼料組成

1.2 微生物總DNA提取

分別稱取各糞便中心樣品200 mg，放入2 mL離心管中，加入1.4 mL ASL緩沖液，振蕩混勻后，用TIANamp Stool DNA糞便提取試劑盒(Tiangen Biotech, Beijing)提取林麝糞便中總DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。通過0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，同時采用Nano Drop 3300(Thermo Scientific)對DNA進行濃度檢測。

1.3 目的片段PCR擴增及測序

選擇16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域作為擴增和測序的目的區(qū)間，擴增片段長度為480 bp。引物序列：338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR擴增采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，并嚴(yán)格控制擴增循環(huán)數(shù)，使循環(huán)數(shù)盡可能低的同時，也保證同一批樣本的擴增條件一致。反 應(yīng) 體 系25 μl：5×reaction buffer 5 μl，5×GC buffer 5 μl，dNTP(2.5 mM) 2 μl，F(xiàn)orwardprimer(10 μM) 1 μl，Reverseprimer(10 μM) 1 μl，DNA Template 2 μl，ddH2O 8.75 μl，Q5 DNA Polymerase 0.25 μl。PCR 擴增條件：98 ℃ 2 min；20～30個循環(huán)(循環(huán)數(shù)根據(jù)樣品本身進行微調(diào))：98 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，10 ℃ 30 min。PCR擴增產(chǎn)物通過2 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標(biāo)片段進行切膠回收，回收采用AXYGEN公司的AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR擴增回收產(chǎn)物進行熒光定量，熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量儀器為Microplate reader(BioTek，F(xiàn)Lx800)。根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應(yīng)比例進行混合，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。樣本在派森諾生物公司進行測序，測序平臺為IlluminaMiseq300PE。

1.4 測序數(shù)據(jù)分析方法

測序原始數(shù)據(jù)以FASTQ格式保存：R1. fastq和R2. fastq，Read 1和Read 2序列一一配對，采用滑動窗口法對FASTQ格式的雙端序列逐一做質(zhì)量篩查，隨后，利用FLASH軟件(v1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)，對通過質(zhì)量初篩的雙端序列根據(jù)重疊堿基進行配對連接，將連接后的Barcode序列識別分配入對應(yīng)樣本，從而獲得有效序列。接著運用QIIME軟件[10](Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http://qiime.org/)識別疑問序列。除了要求序列長度≥150 bp，且不允許存在模糊堿基N之外，還將剔除：①5’端引物錯配堿基數(shù)>1的序列；②含有連續(xù)相同堿基數(shù)>8的序列。隨后，通過QIIME軟件調(diào)用USEARCH(v5.2.236, http://www.drive5.com/usearch/)檢查并剔除嵌合體序列。QIIME軟件，調(diào)用UCLUST這一序列比對工具[11]，對前述獲得的序列按97 %的序列相似度進行歸并和OTU劃分，并選取每個OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。對于每個OTU的代表序列分類地位鑒定，在QIIME軟件中默認(rèn)采用Greengenes數(shù)據(jù)庫(Release 13.8，http://greengenes.secondgenome.com/)，通過將OTU代表序列與對應(yīng)數(shù)據(jù)庫的模板序列相比對，獲取每個OTU所對應(yīng)的分類學(xué)信息。

獲得各水平(界、門、綱、目、科、屬)的注釋文件后，使用R軟件將門和科分類水平的鑒定結(jié)果繪制成柱狀圖，對OTU豐度矩陣中的全體樣本在90 %的最低測序深度水平，統(tǒng)一進行隨機重抽樣，獲得稀疏化(Rarefied)OTU豐度矩陣，繪制稀疏曲線和物種累積曲線。每個樣本在相同測序深度下測得的Alpha多樣性指數(shù)Chao1、ACE、Shannon、Simpson，使用IBM SPSS Statistics ver. 19進行顯著性分析。通過R軟件，對屬水平的群落組成結(jié)構(gòu)進行PCA分析，繪制二維圖形，根據(jù)OTU豐度矩陣和樣本分組數(shù)據(jù)構(gòu)建PLS-DA判別模型。用QIIME軟件進行ANOSIM分析，排列數(shù)設(shè)置為999，通過置換檢驗評價原始樣本組間差異的統(tǒng)計學(xué)顯著性。用PICRUSt(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/tool_runner?tool_id=PICRUSt_normalize)[12]進行功能預(yù)測；基于京都基因組百科全書的KEGG orthology數(shù)據(jù)庫，對同源基因功能進行歸類。使用R軟件，對豐度前50位的功能類群進行聚類分析并繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量分析

通過Illumina MiSeq測序平臺，將測序所得原始雙端測序拼接成一條序列，去掉低質(zhì)量的序列及嵌合體序列最后獲得有效序列。最終一共獲得1 076 941條有效序列，雄性樣本平均為(57 504±8187)條序列，雌性樣本平均為(50 190±6963)條序列。按序列相似度大于97 %的標(biāo)準(zhǔn)對有效序列進行OTU聚類，最終共獲得8292個OTUs，OTU個數(shù)雄性樣本平均為2015±166，雌性樣本平均為1801±385。

2.2 菌群的α多樣性分析

根據(jù)觀察雄性和雌性的OTUs的稀釋曲線，0～1萬多條序列測序深度，曲線急劇上升，不斷發(fā)現(xiàn)新的OTUs，此后稀釋曲線逐漸趨于緩慢，到達(dá)2萬多條序列的測序深度時，測序的結(jié)果已足夠反映當(dāng)前樣本所包含的多樣性(圖1A)。物種累積曲線在5～10個樣本量時，呈現(xiàn)急劇上升的形態(tài)，不斷發(fā)現(xiàn)大量的新物種，到達(dá)20個樣本量時，曲線趨于平緩，表明樣本量已足以反映群落的豐富度(圖1B)。將所有樣品標(biāo)準(zhǔn)化到 20 194條序列，得到4個多樣性指數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)t檢驗分析后發(fā)現(xiàn)，2組間無論是微生物豐富度還是微生物多樣性在組間均無顯著差異(P>0.05)。發(fā)現(xiàn)雄性的chao1、ACE、Shannon和Simpson 4個指標(biāo)都高于雌性(表2)，表明雄性微生物的豐富度多樣性高于雌性。

2.3 不同分類水平菌群的組成差異

在本次研究中檢測到的雄性腸道微生物共包含1個界(細(xì)菌)，16個門，29個綱，46個目，87個科，156個屬和176個種(表3)；雌性腸道微生物共包含1個界(細(xì)菌)，15個門，28個綱，48個目，89個科，155個屬和176個種(表3)?？梢园l(fā)現(xiàn)雄性定義了更多的門，綱和屬的細(xì)菌分類，而雌性定義了更多的目和科的細(xì)菌分類，同時雌雄2組定義了相同數(shù)目的種。

表2 林麝不同性別下糞便菌群多樣性指數(shù)統(tǒng)計

A：(觀察的OTUs)的稀釋曲線 ；B：物種累積曲線A:The rarefaction curve of observed_species; B:Species accumulation curves圖1 林麝糞便菌群Alpha多樣性分析Fig.1 Alpha diversity analysis

表3 林麝糞便20個樣本在不同分類學(xué)水平上的群落組成

2.4 門水平菌群的組成差異

對雄性和雌性共有的17個主要門類進行了柱狀圖展示，其中在雄性主要的3個門類分別是Firmicutes(63.39 % ± 19.20 %)，Proteobacteria(19.52 % ± 21.72 %)和Bacteroidetes(14.81 % ± 6.82 %)，在雌性主要的3個門類分別是Firmicutes (57.27 % ± 12.57 %)，Bacteroidetes(19.92 % ± 6.50 %)和Proteobacteria(18.44 % ± 16.12 %)。此外還有一些所占比例較小的門類，Tenericutes在雄性所占比例為0.87 % ± 0.63 %，在雌性占0.96 % ± 0.80 %。Verrucomicrobia在雄性所占比例為0.48 % ± 0.77 %，在雌性占1.59 % ± 2.83 %。發(fā)現(xiàn)不同的門類在不同性別中存在比例上的差異，雌性和雄性的第一大優(yōu)勢門類都是Firmicutes，而在第二大優(yōu)勢門類則不同，雄性是Proteobacteria，雌性是Bacteroidetes (圖2 A)。在個體樣本中，也發(fā)現(xiàn)比較明顯的個體門類組成差異，雄性個體編號4209、4205、4199和4245這4個樣本中Proteobacteria所占比例高，而其他雄性個體編號Proteobacteria所占比例低，同時雌性也存在個體上的組成差異現(xiàn)象(圖2B)。

2.5 科水平菌落的組成差異

對雄性和雌性共有21個主要的科水平細(xì)菌分類進行了柱狀圖展示，雄性的主要科為Ruminococcaceae(26.73 % ± 10.35 %)、Lachnospiraceae(20.58 % ± 10.79 %)、*Clostridiales(11.88 % ± 4.80 %)、Pseudomonadaceae(10.80 %±17.52 %)、Bacteroidaceae(7.36 %±5.27 %) 和Enterobacteriaceae(7.16 %±13.43 %)，雌性的主要科為Ruminococcaceae(24.71 % ± 6.04 %)、Lachnospiraceae(14.27 % ± 6.74 %)、*Clostridiales(12.72 % ± 5.01 %)、*Bacteroidales(7.89 % ± 6.60 %)Pseudomonadaceae(7.71 % ± 10.43 %)和Bacteroidaceae(6.32 % ± 4.36 %)。Ruminococcaceae，Lachnospiraceae和*Clostridiales都是雌雄在科水平的主要優(yōu)勢菌群，此外雄性的第4大優(yōu)勢菌群是Pseudomonadaceae，而雌性的第4大優(yōu)勢菌群是*Bacteroidales，Enterobacteriaceae在雄性所占比例高于雌性。S24-7所占比例較低，在雌雄中存在顯著差異，在雄性中含量更高。結(jié)果可以明顯反映出雌雄的科水平的門類組成比例差異(圖2 C)。在個體樣本中，發(fā)現(xiàn)雄性樣本4199的第一大優(yōu)勢菌群是Enterobacteriaceae；Moraxellaceae在雌性樣本5010中所占比例較高；Verrucomicrobiaceae在雌性樣本4244中所占比例較高。相同細(xì)菌在不同個體所占比例的差異直接反映了個體差異的存在(圖2D)。

2.6 聚類差異比較分析

對2個試驗組共計20個樣本進行主成分分析及以偏最小二乘回歸的判別模型分析。主成分分析中PC1的貢獻(xiàn)值為41.08 %，部分雄性和雌性的距離非常近，雄性更多地分布在左邊區(qū)域；PC2的貢獻(xiàn)值為23.43 %，也存在雌性和雄性相似的情況，但雌性更多地分布在下方區(qū)域。發(fā)現(xiàn)雌性和雄性也存在一定的差異，但是聚類的效果不太好，主要是由個體差異造成的(圖3 A)。為了更好展示雌性和雄性之間存在的差異，進行了以偏最小二乘回歸的判別模型分析，發(fā)現(xiàn)雌性和雄性兩組之間的樣本距離比較遠(yuǎn)，明顯反映出兩者之間存在一定的差異，不過在同一分組中雌性樣本距離分散，重復(fù)性不好，而在同一分組中雄性樣本距離近，重復(fù)性好(圖3 B)。此外，在考慮到物種存在情況下未加權(quán)的UniFrac(ANOSIM：R2= 0.020，P=0.025)存在顯著差異，也可以反映出雌雄之間存在一定的差異性。

A. 雌性和雄性主要的門水平組成，B. 20個樣本的主要門水平組成，C. 雌性和雄性主要的科水平組成，D. 20個樣本的主要科水平組成;每個條帶代表一個分組細(xì)菌平均的相對豐度，或代表一個個體細(xì)菌的相對豐度。門水平排名前10和屬水平排名前15的細(xì)菌分類被展示。others代表其他細(xì)菌分類及未注釋出來的細(xì)菌分類，若科水平菌群沒有菌名或菌被注釋為others，則用其科以上菌名加“*”表示A:Microbial composition of different groups at Phylum level; B:Microbial composition of 20 individuals at Phylum level; C:Microbial composition of different groups at family level; D:Microbial composition of 20 individuals at family level;Each bar represents the average relative abundance of each bacterial taxon within a group or individuals. The top 10 abundant taxa are shown at Phylum level and 15 abundant taxa are shown at family level.Others represent other bacterial taxa and undefined bacterial taxa.Moreover,sequences without bacterial name or assigned as others would be defined at family level marked with‘*’圖2 林麝糞便不同分組和個體的微生物組成Fig.2 Microbial composition of different groups and individuals

2.7 菌群代謝功能聚類分析

在豐度前50的功能類群聚類的熱圖(圖4，封三)發(fā)現(xiàn)一定的功能差異，可以看到明顯的紅色和綠色的模塊分區(qū)。特別是4199、4232、4227、4196和4207這幾個雄性樣本存在很多相同的功能類群，其他的雄性樣本存在一定模塊區(qū)域相似性，也反映出來了一定的個體差異。通過菌落功能類群聚類發(fā)現(xiàn)雌性和雄性微生物代謝功能存在差異，為了更加準(zhǔn)確地反映這種差異性，還需要進行宏基因組研究。

3 討 論

本研究中主要利用Illumina MiSeq測序平臺進行高通量測序研究了人工飼喂下雄性和雌性林麝微生物腸道微生物的組成。結(jié)果顯示，人工飼喂下雄性和雌性腸道微生物的豐富度和多樣性不存在顯著差異，雄性的豐富度和多樣性要略微高于雌性。之前，有學(xué)者對野生-圈養(yǎng)林麝及健康-腹瀉林麝進行研究，也沒有發(fā)現(xiàn)腸道微生物的豐富度和多樣性存在顯著性的差異[13]，而在高山麝-林麝的研究中發(fā)現(xiàn)了顯著差異[14]，說明物種間的差異性高于物種內(nèi)部之間的差異性。這與前人關(guān)于人類性別差異對腸道微生物豐富度和多樣性影響的研究結(jié)論“女性的普遍高于男性”相反。當(dāng)然背景差異也會影響，比如：年齡、飲食習(xí)慣、地理位置、健康狀況等[13-14]。此外，在從肉食性到草食性的轉(zhuǎn)變中，腸道細(xì)菌的多樣性也會顯著增加[15]。大部分研究認(rèn)為，腸道微生物的豐度和多樣性越高，越能反映出一個健康的腸道環(huán)境，維持微生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)平衡，確保正常的生理功能。

A. 基于歐式距離的三維主成分分析(PCA)；B. 以偏最小二乘回歸的判別模型(PLS-DA)A:Three-dimensional plot of principal component analysis (PCA) based on Euclidean distance;B:Discriminant model with partial least squares regression (PLS-DA) 圖3 林麝糞便微生物豐度矩陣聚類圖Fig.3 Abundance matrix clustering

相對豐度的柱狀圖顯示了無論雌性還是雄性主要的優(yōu)勢菌都是厚壁菌門(Firmicutes)，雄性林麝所占比例為63.39 %±19.20 %，雌性林麝所占比例為57.27 %±12.57 %。本文的研究結(jié)論基本上與之前對食草動物腸道細(xì)菌群落的描述是一致的，尤其是反芻動物腸道微生物群[16-18]。厚壁菌門組成的細(xì)菌類型，能夠分解食物中的纖維素并將纖維素降解為宿主的揮發(fā)性脂肪酸，還可以調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫反應(yīng)，抑制機會性病原體的入侵并預(yù)防腸道炎癥。其中瘤胃菌科(Ruminococcaceae)，毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)和梭菌目(*Clostridiales)都屬于厚壁菌門。擬桿菌門(Bacteroidetes)細(xì)菌的主要功能是幫助宿主降解碳水化合物(尤其是多糖)、蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)，以提高宿主的營養(yǎng)利用率[19]，雄性林麝所占比例為14.81 %±6.82 %，雌性林麝所占比例為19.92 %±6.50 %，由此可見擬桿菌門更多富集在雌性腸道中。擬桿菌科(Bacteroidaceae)和擬桿菌目(*Bacteroidales)為擬桿菌門中占優(yōu)勢細(xì)菌分類。這兩種細(xì)菌門類組合也是典型瘤胃微生物區(qū)系，幫助宿主消化動物體自身難以利用的粗纖維，從大量的低營養(yǎng)的植物纖維中攝取所需的能量，而且參與分解代謝有毒物質(zhì)[20]。

本研究中發(fā)現(xiàn)變形菌門(Proteobacteria)在雄性林麝所占比例為19.52 %±21.72 %，雌性林麝所占比例為18.44 %±16.12 %，兩組不存在顯著差異，變形菌門在雄性林麝所占比例高于雌性林麝，并且在雄性中個體差異比較大。之前周美麗等[21]在對6只健康圈養(yǎng)雄性林麝研究中，發(fā)現(xiàn)變形菌門所占比例為5.2 %±5.6 %，也發(fā)現(xiàn)相同的細(xì)菌分類在不同個體中存在明顯的差異，但是本文變形菌門所占的比例是之前研究的3倍之多。Mao等人[22]在奶牛的小腸中發(fā)現(xiàn)了大量變形菌門，在粘膜樣本中所占比例為37.26 %，消化物樣本中高達(dá)45.6 %。因此，在不同的動物個體、不同腸道部位和樣本來源中變形菌門的定植也許是可變的。變形菌門的流行率是不穩(wěn)定微生物群落的一個標(biāo)志(生態(tài)失調(diào))和疾病的潛在診斷標(biāo)準(zhǔn)，低纖維飲食和急性或慢性炎癥都會導(dǎo)致變形菌門在胃腸道富集[23]?？梢酝茰y，在該研究中人工圈養(yǎng)的林麝健康狀況不佳，可能存在慢性炎癥的情況。假單胞菌科(Pseudomonadaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae) 屬于變形菌門，這兩類細(xì)菌對宿主具有潛在致病的機會，本文研究中在雄性林麝所占比例高于雌性林麝，而且在之前Li等人[12]對腹瀉與健康林麝的腸道微生物研究中發(fā)現(xiàn)，腹瀉組包含有更多腸桿菌科下的細(xì)菌屬類，間接證明了該研究中雄性林麝更易于患上腹瀉等疾病。

在主成分和回歸的判別模型及菌群代謝功能的聚類分析中，雄性和雌性在細(xì)菌聚類距離和功能作用上存在一定的差異性。與雌性相比之下雄性10個樣本距離近，重復(fù)性效果好。Li等人[12]對野生和圈養(yǎng)林麝的腸道微生物研究中，在圈養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)更多的變形菌門。野生林麝以各種高纖維植物的葉子為食，圈養(yǎng)的林麝以人工喂養(yǎng)的樹葉、高蛋白和多糖為食，而這兩種喂養(yǎng)方式之間存在著巨大的差異。Filippo等人[23]在非洲與歐洲兒童研究中，非洲兒童主要富集更多的擬桿菌門，歐洲兒童富集更多的厚壁菌門。而飲食習(xí)慣在其中扮演著重要的角色，非洲兒童是典型的素食者，食物組成里脂肪和動物蛋白含量較低，主要是富含淀粉、纖維和植物多糖的食物，而歐洲兒童是典型的西方飲食，富含動物蛋白、糖、淀粉、脂肪和低纖維；非洲兒童的腸道細(xì)菌產(chǎn)生更多的短鏈脂肪酸有利于抵御疾病，而歐洲兒童含有更多Enterobacteriaceae等潛在致病菌，更容易發(fā)生腸道疾病。對比之下，在雄性中發(fā)現(xiàn)更多的厚壁菌門和變形菌門，而在雌性中發(fā)現(xiàn)更多的擬桿菌門?？梢酝茰y，雄性更偏好飼喂的精細(xì)飼料，攝入的食物成分相似造成微生物組成差異小，而部分雌性林麝更偏好自由采食的青綠飼料，所以造成雄性和雌性環(huán)境適應(yīng)能力及抗病性能差異，但是這種雌雄差異存在很大的個體差異性。目前，圈養(yǎng)的林麝總是有很高的腸道疾病發(fā)病率，也反映出目前的精細(xì)飼料并不能完全滿足林麝的營養(yǎng)需求，需提高青綠飼料的比重和多樣性，模擬野外林麝攝食組成，更有利于林麝的健康成長。

4 結(jié) 論

通過高通量測序和生物信息學(xué)分析對林麝的糞便微生物群進行了研究，結(jié)果顯示，林麝的糞便微生物以厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門為主。雄性林麝和雌性林麝在微生物的豐富度和多樣性不存在顯著差異，在微生物的組成成分上相似，不同細(xì)菌分類在個體上有明顯的變化。細(xì)菌功能聚類分析反映了雌性和雄性存在一定差異，是飲食偏好差異還是宿主基因型差異造成的還需要進一步研究。該研究圈養(yǎng)下的林麝腸道微生物含有較高比重的變形菌門，存在很多機會致病菌。建議應(yīng)增加飼料中的粗纖維成分，防止林麝出現(xiàn)嚴(yán)重的腸道疾病。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，不僅是林麝糞便微生物的研究，應(yīng)該全面展開對健康與非健康不同腸段林麝腸道微生物的研究，將直接有利于林麝養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。