低溫對(duì)枇杷苗葉片與根尖的生理狀況及超微結(jié)構(gòu)的影響

杜麗君,牛先前,林曉紅,張玉容,鄭國華*

(1.漳州城市職業(yè)學(xué)院，福建 漳州 363000；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 350002；3.福建省熱帶作物科學(xué)研究所，福建 漳州 363001)

枇杷(Eriobotrya japonica)是著名的名優(yōu)特水果，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，枇杷開花座果期一般在11月至次年1月，此時(shí)正值一年中氣溫最低的季節(jié)，花果極易受凍。凍害是限制枇杷生產(chǎn)的重要因子。有關(guān)枇杷凍害發(fā)生機(jī)制的研究有較多報(bào)道，涉及葉片[1-6]、幼果[7-12]和枇杷外生菌(冰核細(xì)菌)[8-10,13]、抗寒基因[14-15]、轉(zhuǎn)錄組[16]等方面。枇杷凍害機(jī)制的理論研究為解決枇杷凍害提供了思路,也為緩解枇杷凍害起到了積極作用，但低溫仍然是限制枇杷生產(chǎn)的主要因子。前人的研究表明，枇杷葉片和幼果在耐寒生理方面具有密切相關(guān)性[17]，作為植物生產(chǎn)力和養(yǎng)分利用率的重要驅(qū)動(dòng)者——地下部，直接參與養(yǎng)分活化、轉(zhuǎn)化、吸收和運(yùn)輸?shù)冗^程，通過緊密而復(fù)雜的物質(zhì)和信息交換，實(shí)現(xiàn)各要素間的相互作用[18]。地上部與地下部在資源獲取和利用方面又具有相對(duì)獨(dú)立性[18]。已有研究表明，地下部的低溫條件會(huì)造成地上部的低溫傷害并影響其低溫傷害程度[19-20]。植物地下部能顯著影響地上部的抗逆性，這在黃瓜(Cucumis sativus)[21]、茄子(Solanum melongena)[22]嫁接苗的抗冷性以及葡萄(Vitis vinifera)[23]嫁接苗的抗旱性上均獲得了證實(shí)。因此，研究枇杷地下部與地上部低溫脅迫下的生理變化，認(rèn)識(shí)枇杷地上與地下在耐寒生理方面的相關(guān)性，對(duì)解決枇杷凍害問題具有重要意義。本文以較不耐寒品種‘解放鐘’枇杷苗為材料，人工模擬自然低溫條件，在透射電鏡下觀察低溫下根尖和葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，并結(jié)合低溫脅迫下的相關(guān)生理變化，探討枇杷地上部與地下部的抗寒生理相關(guān)性，以期為枇杷凍害問題提供解決思路。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2011年10月至2014年1月在福建農(nóng)林大學(xué)園藝場進(jìn)行。供試枇杷(Eriobotrya japonica)品種為 ‘解放鐘’實(shí)生苗，選擇長勢(shì)健壯、無病蟲害且整齊度高的1年齡枇杷苗，移入培養(yǎng)缽(直徑20 cm)進(jìn)行單株培養(yǎng)，培養(yǎng)基質(zhì)為果園土∶復(fù)合肥=20∶1，統(tǒng)一管理。生長1年半后，選擇株高30～35 cm，生長健壯、無病蟲危害的枇杷苗285株為低溫處理試驗(yàn)材料。

1.2 低溫處理

參考謝鐘琛等[24]的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置3個(gè)處理溫度：0℃、-3℃和-5℃。枇杷苗在10℃低溫鍛煉2 d后,采用梯度降溫法，將植株放入改裝的可控溫冰柜(上海精創(chuàng) ETC-100通用型溫控儀控溫)，以10℃ h-1降溫到4℃維持10 h，再以2℃ h-1降溫到設(shè)置溫度。在0℃、-3℃、-5℃分別脅迫0(對(duì)照)、12、24、36、48、60和72 h后，將植株在10℃恢復(fù)生長2 d后統(tǒng)計(jì)枇杷苗受害情況，葉片以褐變面積大于總面積1/2判定為受凍害褐變[13]。所有處理均在室內(nèi)進(jìn)行，每處理5株，重復(fù)3次。葉片褐變率=植株褐變?nèi)~片總數(shù)/植株葉片總數(shù)×100%。

1.3 電鏡觀察

取從頂葉算起第4片功能葉，取完為止，用蒸餾水洗凈，吸干，然后用鋒利刀片沿主脈中部兩側(cè)取0.5 mm×1 mm的組織塊，每片葉在相同部位切取4片，重復(fù)5次。

割開營養(yǎng)缽后用自來水浸泡，待土松軟后獲得完整根系，用自來水洗凈根系，再用蒸餾水清洗,吸水紙吸干，然后用鋒利刀片從根尖向內(nèi)1 cm處取0.5 mm×1 mm的組織塊4片，重復(fù)5次。

參照鄭國華等[7]的方法制備超薄切片。將切取好的組織塊迅速投入用含2%焦銻酸鉀的磷酸緩沖液(pH 7.6)配制的3%戊二醛固定液中，脫氣后于4℃固定1 d以上；用2%焦銻酸鉀-0.1 mol L-1磷酸氫二鉀(pH 7.6)洗滌4次，每次30 min，4℃過夜；將材料轉(zhuǎn)移至用含2%焦銻酸鉀的磷酸緩沖液(pH 7.6)配制的1%鋨酸中，4℃冰箱內(nèi)固定4 h；然后重蒸水洗滌4次，每次30 min，冷乙醇梯度脫水，丙酮過渡，環(huán)氧樹脂618包埋，LKB-5型超薄切片機(jī)切片(厚度50 nm)，經(jīng)醋酸雙氧鈾染色后，在JEM1010型透射電鏡(日本電子株式會(huì)社，日本)下觀察照相。

1.4 生理指標(biāo)的測定

根系活力測定參考張志良等[25]的方法；細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性(PMP)的測定參考李合生[26]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用DPS軟件的新復(fù)極差法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用SigmaPlot作圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

透射電鏡下，正常枇杷葉肉細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞膜完整，液泡很大占據(jù)中央；葉綠體呈橢圓形或近圓形，雙層膜完整，且沿細(xì)胞膜排列,切面上可見葉綠體內(nèi)嵌3～5個(gè)明亮的淀粉粒(圖1：A)；淀粉粒周圍分布垛疊規(guī)則的類囊體片層，并和基質(zhì)片層連成整體(圖1：B)；線粒體分布在葉綠體周圍，呈圓形或橢圓形，雙層膜結(jié)構(gòu)完整，嵴清晰且數(shù)量較多(圖 1：C)。

0℃脅迫12 h葉肉細(xì)胞的細(xì)胞壁未有明顯變化(圖1：D)，葉綠體淀粉粒清晰，基粒片層排列有序，但片層之間出現(xiàn)明顯間隙(圖1：D,E)；線粒體數(shù)量增加2～3倍且嵴更清晰(圖1：E)。脅迫24 h的葉綠體雙層膜結(jié)構(gòu)破壞，淀粉粒清晰，基粒片層垛疊程度降低；線粒體結(jié)構(gòu)保持完整且嵴數(shù)量明顯增加(圖1：F)。脅迫36 h的葉綠體雙層膜結(jié)構(gòu)消失,淀粉粒變小，基粒片層結(jié)構(gòu)解體明顯(圖1：G)；線粒體膜及嵴模糊不清，細(xì)胞內(nèi)含物明顯增多，細(xì)胞壁變化不明顯(圖1：G)。脅迫48 h的葉綠體邊緣解體，淀粉粒開始消失(圖1：H)，線粒體變形，雙層膜破裂，嵴消失(圖1：I)。脅迫60 h細(xì)胞解體嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)散布小泡、片層、絮狀物，細(xì)胞器只有線粒體依稀可辨(圖 1：J)。

-3℃脅迫12 h的葉綠體發(fā)生膨脹、扭曲，雙層膜斷裂，基粒片層松散但排列依然整齊(圖1：K)；線粒體數(shù)量增多但嵴數(shù)量減少，并少數(shù)出現(xiàn)空胞化(圖1：K)。脅迫24 h細(xì)胞壁完好，液泡完全破裂，葉綠體脹裂，雙層膜消失，基粒片層松散并出現(xiàn)解體,淀粉粒清晰(圖1：L)；細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量絮狀物，線粒體明顯空胞化但尚可辨認(rèn)(圖1：M)。脅迫36 h后各細(xì)胞器解體嚴(yán)重，形態(tài)紊亂，細(xì)胞中零星分布?xì)埓娴男∨?、顆粒和葉綠體片層(圖1：N)。脅迫60 h細(xì)胞器完全解體難以辨別(圖1：O)。

-5℃脅迫12 h的葉綠體膨漲變形，淀粉粒清晰，葉綠體被膜消失(圖1：P)；片層結(jié)構(gòu)松散斷裂(圖1：Q)，線粒體數(shù)量增加2～3倍，嵴消失，內(nèi)部出現(xiàn)解體和空胞化，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞明顯(圖1：Q)。24 h后原生質(zhì)體縮成一團(tuán)，細(xì)胞器解體嚴(yán)重難以辨別(圖 1：R)。

2.2 根細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

透射電鏡下觀察，常溫下枇杷根細(xì)胞有明顯的質(zhì)壁分離，中央液泡很大并將其他細(xì)胞器擠到邊緣，細(xì)胞中無葉綠體(圖2：A)，液泡膜結(jié)構(gòu)清晰可見，線粒體呈圓形或橢圓形，雙層膜結(jié)構(gòu)明顯，嵴清晰(圖 2：B)。

0℃脅迫12 h，根細(xì)胞液泡膜破裂，泡內(nèi)基質(zhì)外流；線粒體數(shù)量增多2～3倍(圖2：C)，雙層膜結(jié)構(gòu)完整、嵴清晰，細(xì)胞壁有破壞現(xiàn)象(圖2：C)。脅迫24 h，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變得松散，內(nèi)側(cè)出現(xiàn)絮狀物(圖2：D)；線粒體變形，雙層膜模糊，但嵴依然清晰(圖2：E)。脅迫36 h，細(xì)胞壁破壞加劇，線粒體膜破裂，嵴消失，空胞化嚴(yán)重(圖2：F)。脅迫48 h時(shí)，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯間隙(圖2：G)，線粒體少量依稀可辨，大部分被膜破裂或消失，嵴嚴(yán)重解體(圖2：H)。脅迫60 h時(shí)，細(xì)胞壁破壞嚴(yán)重，線粒體解體為絮狀物難以辨別(圖 2：I)。

-3℃脅迫12 h，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞明顯，液泡消失，原生質(zhì)體縮成一團(tuán)聚在中間(圖2：J)，細(xì)胞壁邊緣解體出現(xiàn)絮狀物(圖2：K)，線粒體數(shù)量增多2～3倍，形態(tài)完整但嵴的數(shù)目明顯減少且部分出現(xiàn)空胞化(圖2：L)。脅迫24 h時(shí)細(xì)胞壁胞內(nèi)一側(cè)解體加劇(圖2：M)，線粒體依稀可辨，嵴嚴(yán)重解體或消失(圖2：N)。脅迫36 h后，細(xì)胞嚴(yán)重破壞，細(xì)胞器完全解體，無法辨認(rèn)(圖 2：O)。

-5℃脅迫12 h，細(xì)胞器聚成一團(tuán)，線粒體外膜破裂、內(nèi)嵴解體，較難識(shí)別(圖2：P)。脅迫24 h時(shí)，細(xì)胞壁破壞嚴(yán)重，細(xì)胞器解體，殘?bào)w散落在細(xì)胞各處(圖2：Q)。脅迫36 h后，細(xì)胞器完全解體，細(xì)胞內(nèi)充滿絮狀物(圖 2：R)。

2.3 葉片受害情況

圖 2 低溫脅迫過程中根細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化(箭頭)。A,B：正細(xì)胞；C：0℃脅迫 12 h；D,E：0℃脅迫 24 h；F：0℃脅迫 36 h；G,H：0℃脅迫 48 h；I：0℃脅迫60 h；J～L：-3℃脅迫 12 h；M,N：-3℃脅迫 24 h；O：-3℃脅迫 36 h；P：-5℃脅迫 12 h；Q：-5℃脅迫 24 h；R：-5℃脅迫 36 h。Fig.2 Changes in structure of root cells under low temperature stress(arrows).A,B：Normal cel；C：Under 0℃ for 12 h；D,E：Under 0℃ for 24 h；F：Under 0℃ for 36 h；G,H：Under 0℃ for 48 h；I：Under 0℃ for 60 h；J-L：Under-3℃ for 12 h；M,N：Under-3℃ for 24 h；O：Under-3℃ for 36 h；P：Under-5℃ for 12 h；Q：Under-5℃ for 24 h；R：Under-5℃ for 36 h.

低溫脅迫下，最先出現(xiàn)低溫傷害癥狀的是幼葉 (約占20%)、其次為成熟功能葉(約占60%)、最不敏感的是老葉(約占20%)。由圖3可見，0℃脅迫12～36 h，葉片褐變率僅增加5.02%，受凍葉片基本為幼葉，而在低溫持續(xù)48 h后，成熟葉片出現(xiàn)傷害癥癥狀，脅迫60 h后51.37%的葉片呈現(xiàn)低溫受害癥狀。而-3℃脅迫12 h的傷害癥狀與0℃脅迫60～72 h的相當(dāng)。枇杷苗在-5℃脅迫12 h后表現(xiàn)出完全凍害癥狀。這說明葉片褐變率與脅迫溫度呈反比,與脅迫時(shí)間呈正比，且-3℃脅迫36 h和-5℃脅迫12 h即表現(xiàn)完全凍害癥狀。

2.4 低溫對(duì)根系活力的影響

由圖3可見，在0℃、-3℃、-5℃下，枇杷苗的根系活力隨脅迫時(shí)間的延長整體呈下降趨勢(shì)，且溫度愈低，根系活力下降幅度愈大。0℃脅迫12 h的根系活力顯著下降26.09%(P＜0.05)，之后根系活力緩慢下降但未達(dá)到顯著水平，說明隨0℃脅迫時(shí)間的延長，根系受害程度增加。-3℃脅迫0～12、12～24 h的根系活力分別下降32.74%和26.01%，均達(dá)極顯著差異，脅迫24 h后變化平緩，說明-3℃脅迫根系即持續(xù)受害。-5℃脅迫12 h的根系活力極顯著下降42.13%(P＜0.01)，之后則下降平緩，說明-5℃脅迫使根系受害嚴(yán)重。

2.5 細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性(PMP)的變化

由圖4：A可見，在0℃、-3℃和-5℃脅迫下,葉片的PMP隨脅迫時(shí)間的延長呈持續(xù)上升趨勢(shì)，且溫度越低上升幅度越高。0℃脅迫12 h，PMP顯著上升37.47%(P＜0.05)，脅迫48h的PMP僅上升23.6%，與脅迫12h的差異不顯著。-3℃脅迫下，PMP隨脅迫時(shí)間的延長持續(xù)上升，不同時(shí)間間均達(dá)到差異顯著水平。-5℃脅迫12 h的PMP極顯著上升51.19%(P＜0.01),之后仍緩慢上升，說明低溫脅迫對(duì)葉片造成受害。

圖3 低溫脅迫下枇杷苗葉片褐變率和根系活力的變化。不同英文字母表示差異顯著(P＜0.05)。下同。Fig.3 Changes in leaf browning rate and root vigor of loquat seedlings under low temperature stress.Different letters indicate significant difference at 0.05 level.The same is following figure.

圖4 低溫脅迫對(duì)枇杷苗葉(A)、根(B)的PMP變化Fig.4 Changes in leaf(A)and root(B)PMP of Eriobotrya japonica under low temperature stress

由圖4：B可見，在0℃、-3℃、-5℃脅迫下，根系的PMP隨脅迫時(shí)間的延長均呈上升趨勢(shì)，且脅迫溫度愈低，PMP上升愈高。0℃脅迫12 h的PMP極顯著上升36.49%(P＜0.01)，之后緩慢上升。-3℃脅迫12、72 h PMP分別比脅迫0、60 h顯著上升了36.74%和13.72%(P＜0.05)。-5℃脅迫12、24和36 h的PMP分別比脅迫0、12、24 h顯著上升44.32%、7.53%和8.46%(P＜0.05)。

3 討論

許多研究表明，低溫脅迫下植物細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象[6]，因質(zhì)壁分離可以引起液泡脫水,從而使液泡縮小以增加原生質(zhì)濃度來減輕低溫傷害[27]。質(zhì)壁分離程度越高，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞程度越大,表明細(xì)胞抗低溫能力越弱[28]。本研究中枇杷植株在10℃低溫鍛煉2 d后，根細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離和液泡縮小現(xiàn)象，而葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)略有變化但未出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象，說明根細(xì)胞的抗低溫能力弱于葉肉細(xì)胞。

低溫脅迫下細(xì)胞可以通過消耗呼吸底物，增強(qiáng)呼吸作用，提高能量代謝來抵抗低溫傷害。電鏡下觀察表明，低溫脅迫后線粒體和嵴數(shù)量增多[8]。本研究中，輕度低溫(0℃)脅迫下根細(xì)胞和葉肉細(xì)胞的線粒體和嵴數(shù)量均明顯增多，這與前人的研究結(jié)果一致。隨脅迫時(shí)間的延長，根細(xì)胞和葉肉細(xì)胞對(duì)低溫表現(xiàn)出明顯差異，根細(xì)胞線粒體雙層膜破裂、嵴消失的現(xiàn)象比葉肉細(xì)胞早發(fā)生12 h，這可能是葉肉細(xì)胞中的淀粉粒為逆境呼吸提供了更多的呼吸底物。淀粉是葡萄糖分子聚合而成的長鏈化合物，逆境下淀粉?？梢灾匦路纸鉃槠咸烟?，作為呼吸底物，參加三羧酸循環(huán)。而根細(xì)胞比葉肉細(xì)胞缺少了淀粉粒，這可能是導(dǎo)致地下部抗寒性低于地上部的一個(gè)重要因素。

膜體系的損傷是造成植物受害的根本機(jī)制[29-30]。細(xì)胞發(fā)生冰凍傷害會(huì)產(chǎn)生冰晶，造成細(xì)胞脫水[8],脫水時(shí)的收縮直接造成了質(zhì)膜的破壞，表現(xiàn)為液泡破裂、原生質(zhì)體濃縮、葉綠體膨大、線粒體腫脹,類囊體排列不規(guī)則，線粒體膜和嵴消失、細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡化等現(xiàn)象[31]。本研究在-3℃和-5℃脅迫下,根細(xì)胞和葉肉細(xì)胞內(nèi)均結(jié)冰，導(dǎo)致一系列受害現(xiàn)象，葉綠體解體和線粒體的內(nèi)嵴破壞，都是不可逆的，并最終導(dǎo)致植株死亡[32]。

本研究在透射電鏡下觀察表明，低溫不僅會(huì)損傷膜系統(tǒng)，還會(huì)對(duì)細(xì)胞壁造成破壞。細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)構(gòu)成，結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜[33],細(xì)胞壁表面糖蛋白脫落到細(xì)胞間隙中或凝集成塊進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部都是導(dǎo)致個(gè)體間抗寒性差異的原因[31]。因細(xì)胞壁本身沒有生命跡象，所以不會(huì)因低溫而產(chǎn)生直接破壞。而細(xì)胞結(jié)冰就會(huì)對(duì)細(xì)胞壁造成機(jī)械傷害[8]。輕度低溫脅迫36 h，葉肉細(xì)胞壁無明顯受害癥狀，而根細(xì)胞壁明顯破壞，且先發(fā)生在細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)。從細(xì)胞壁的破壞程度和發(fā)生位置可以推測，輕度低溫脅迫引起了根細(xì)胞胞間結(jié)冰。細(xì)胞間因吸水導(dǎo)致體積膨脹，細(xì)胞內(nèi)因缺水導(dǎo)致收縮,是細(xì)胞壁外側(cè)光滑而內(nèi)側(cè)首先損傷的根本原因[8]。

葉片褐變率、根系活力和PMP指標(biāo)可以直接反映葉片和根的凍害程度。輕度低溫脅迫12 h后,根系活力下降26.09%，而葉片褐變率僅升高17.15%,脅迫12～48 h根系PMP值持續(xù)升高而葉片PMP值升高不顯著，表明0℃下枇杷苗根部表現(xiàn)持續(xù)受害，而葉片則表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性，受害癥狀不明顯。這說明地下部較地上部對(duì)低溫更敏感。

綜上所述，枇杷苗葉肉細(xì)胞比根細(xì)胞對(duì)低溫具有更強(qiáng)的適應(yīng)性，一方面是因?yàn)椴煌鞴僭诓煌h(huán)境下長期的適應(yīng)性，可能導(dǎo)致地下部根細(xì)胞的適應(yīng)性弱于地上部葉肉細(xì)胞；另一方面是與底物貯藏量有關(guān)，低溫脅迫下細(xì)胞通過增強(qiáng)呼吸作用提高抗逆性，而無論是三羧酸循環(huán)還是抗氰呼吸在脅迫環(huán)境下都需要消耗大量底物，枇杷苗根細(xì)胞底物的儲(chǔ)備量相對(duì)葉肉細(xì)胞的少，因此更容易受低溫危害。

枇杷苗根尖比葉對(duì)低溫更敏感，因此從防御策略上，對(duì)枇杷園進(jìn)行生草栽培，或在極端低溫到來之前實(shí)施地表覆草、覆蓋等保溫措施，提高地溫,并結(jié)合噴灑防霜?jiǎng)┖椭参锷L調(diào)節(jié)劑類物質(zhì)[10]，來提高枇杷耐寒能力，以期達(dá)到更好的防寒效果。因本研究僅是對(duì)較不耐寒品種，對(duì)耐寒品種地下部與地上部低溫脅迫下的反應(yīng)有待進(jìn)一步研究。