向日葵MADS-Box基因HAM23-like克隆和表達(dá)分析

蘇周,吳雨,雷豆,韋小英,何卓遠(yuǎn),楊軍,鄒建

(西華師范大學(xué)西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)省部共建(教育部)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 南充 637009)

花器官發(fā)育是陸生植物在生殖進(jìn)程中的重要過(guò)程，該過(guò)程對(duì)于開(kāi)花植物的有性生殖具有極其重要的意義。在進(jìn)化過(guò)程中，由于自然選擇的作用和花器官的起源不同，不同開(kāi)花植物之間形態(tài)上存在多樣性[1-3]。典型的雙子葉植物的花從外到內(nèi)由4輪不同的花器官組成，第1輪是萼片，第2輪是花瓣，第3輪是雄蕊，第4輪是心皮[4]。經(jīng)典的ABC模型將假定參與花發(fā)育的基因分為ABC 3類。其中,A類基因控制萼片和花瓣，該類基因功能缺失將導(dǎo)致萼片和花瓣變成心皮和雄蕊；B類基因控制花瓣和雄蕊，該類基因失活花瓣和雄蕊將變成萼片和心皮；C類基因控制雄蕊和心皮，該類基因的缺失將引起雄蕊和心皮變成花瓣和萼片[4]?，F(xiàn)有的研究顯示，ABC模型中參與花器官發(fā)育調(diào)控基因中大多數(shù)都屬于MADS-box基因家族[5]。

MADS-box基因家族在動(dòng)物、植物和真菌中廣泛存在，其在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各階段發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[6-7]。MADS 是MCM1、AGAMOUS、DEFICIENS和SRFS的首字母縮寫(xiě)組成。其中MCM1(minichromosome maintenance1)的功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、生長(zhǎng)、代謝、專一性和決定細(xì)胞類型[8]；AGAMOUS(AG)和DEFICIENS(DEF)均是花器官基因的編碼蛋白,分別來(lái)自擬南芥(Arabidopsis thaliana)和金魚(yú)草(Antirrhinum majus)；SRF(serum response factor)為人類血清應(yīng)答因子[9-11]。這些基因均具有一個(gè)由56～58個(gè)氨基酸組成的高度保守結(jié)構(gòu)域，稱為MADS-box結(jié)構(gòu)域，故將其命名為MADS-box基因[12-13]。MADS-box基因不僅參與調(diào)控開(kāi)花時(shí)間，決定花分生組織的發(fā)生和花器官特征，而且在根、葉、胚珠和果實(shí)的發(fā)育過(guò)程中也起著重要作用[6-13]。Koo等的研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)AGL6基因會(huì)造成擬南芥提前開(kāi)花[14]；此外番茄中的研究證明了MADS-box家族成員rin基因參與果實(shí)成熟的調(diào)控，而SlMBP21基因則控制番茄萼片的大小[15-16]。

向日葵(Helianthus annuus)是典型的菊科(Compositae)植物，頭狀花序由外輪不育的舌狀花(缺乏雄蕊和雌蕊)和內(nèi)部可育的管狀花組成。迄今為止,在形態(tài)學(xué)方面對(duì)菊科植物花形態(tài)和發(fā)育進(jìn)行了大量研究，但從分子遺傳學(xué)的角度來(lái)看，這一種類極多的被子植物科的花序和花的發(fā)育仍不清楚，而MADS-box基因在影響花形成的所有階段都發(fā)揮著重要的作用[17]。到目前為止，關(guān)于向日葵的MADS-box基因研究較少，在控制花序形態(tài)發(fā)生方面，僅有9個(gè)向日葵MADS-box基因被分離和報(bào)道，包括2個(gè)A類基因HAM 75和HAM 92，影響花瓣和種皮的形成；4個(gè)B類基因HAM31、HAM2、HAM63和HAM91；2個(gè)C類基因HAM45和HAM59,HAM59參與花分生組織的終止，并與HAM45共同確定雄蕊和雌蕊；1個(gè)E類基因HAM137[17-18]。研究向日葵的MADS-box基因，能深入了解MADS-box基因?qū)ο蛉湛麪I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)的影響。目前對(duì)向日葵的MADS-box transcription factor 23-like基因尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本文從向日葵花中克隆了1個(gè)與花發(fā)育相關(guān)含有MADS-box結(jié)構(gòu)域的基因，通過(guò)NCBI對(duì)其進(jìn)行序列比對(duì)，確定為向日葵MADS-box transcription factor 23-like(HAM23-like),利用在線生物軟件對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)和生物信息學(xué)分析，隨后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)該基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為探究HAM23-like基因的功能及MADS-box基因?qū)ο蛉湛òl(fā)育的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料是向日葵光霧山野生葵品種(Helianthus annuus‘GWMountainWild’),種于溫室(光 /暗 =16 h/8 h，28℃/24℃)中。分別采集根、莖、葉、花、果實(shí)(MSt，籽粒飽滿階段)后用液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。

E.Z.N.A?Plant RNA Kit購(gòu)于OMEGA；熒光定量染料試劑SYBR?Premix ExTaqTMⅡ、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)等購(gòu)自寶生物(TaKaRa)公司；FastPfuFly DNA聚合酶、克隆載體pEASY?-Blunt Cloning Kit、大腸桿菌DH5α購(gòu)于北京全式金。其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 總RNA提取和合成cDNA

在開(kāi)花前 35(-35)、-25、-15、-10、-5、0 d(開(kāi)花當(dāng)天)、開(kāi)花后5 d(未成熟果實(shí))采集花；并在向日葵開(kāi)花當(dāng)天分別采集根、莖、葉、果實(shí)(籽粒飽滿階段)及6種花器官：苞片、雌蕊、冠毛、花瓣、雄蕊、子房。材料采集后，按照E.Z.N.A?Plant RNAKit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組織的總RNA，然后用瓊脂糖凝膠電泳和NANODROP 2000c檢測(cè)提取RNA的濃度和純度。以所得RNA為模板參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

1.3 基因克隆

根據(jù)向日葵全發(fā)育時(shí)期表達(dá)譜庫(kù)454和向日葵花發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(均未上傳NCBI)篩選到的基因序列，并在NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中比對(duì)獲得目的基因登錄號(hào)(XM_02213319 8.1),根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物transcription factor 23-F/R，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA為模板，擴(kuò)增transcription factor 23基因全長(zhǎng)序列。PCR擴(kuò)增體系共 50μL，包含 cDNA 模板 3μL，transcription factor 23-F/R 引物各 1μL，5×buffer 10μL，dNTP 4μL,ddH2O 30μL 和 FastPfu Fly DNA 聚合酶 1μL，均加入200μL離心管中，用槍尖沖打混勻。擴(kuò)增程序?yàn)?8℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1.5 min，34 次循環(huán)，72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),切膠回收，連接到pEASY?-Blunt vector克隆載體,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含100 mg L-1Kan的LB培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，送至上海生物工程公司測(cè)序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

利用NCBI中在線軟件ORF Finder對(duì)所有擬南芥和向日葵MADS-box基因序列進(jìn)行分析，推導(dǎo)出編碼的氨基酸序列。擬南芥MADS-box基因由擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)獲得利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建擬南芥(https：//www.arabidopsis.org/)和向日葵 MADS-box的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，預(yù)測(cè)向日葵HAM23-like基因與擬南芥的親緣關(guān)系。

1.5 HAM23-like的生物信息學(xué)分析

利用在線軟件ProtScale(http：//web.expasy.org/protscale)和 ExPASy(http：//web.expasy.org/protparam/)分別對(duì)HAM23-like基因編碼蛋白的親/疏水性和理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

使用DNAMAN 8.0軟件對(duì)HAM23-like、擬南芥Agamous-like 18的氨基酸序列和朝鮮薊(Cynara cardunculusvar.scolymus)、萵苣(Lactuca sativa)和番茄(Lycopersicon esculentum)等高等植物的MADS-box transcription factor 23-like基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)。

1.6 HAM23-like的表達(dá)模式

采用實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)，利用Primer primer 5.0設(shè)計(jì)HAM23-like基因的實(shí)時(shí)熒光定量引物，以向日葵eF1A為內(nèi)參基因(表1)。以提取的向日葵cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：SYBR?Premix ExTaqTMⅡ 5μL，Transcripition factor 23-F/R各 1μL，ddH2O 2μL，模板 cDNA 1μL。PCR 反應(yīng)在CFX96 Real-Time PCR儀(Bio-Rad,美國(guó))上完成,3次重復(fù)。先確定最適解鏈溫度(melting temperature,Tm)，再構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后進(jìn)行檢測(cè)。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

2 結(jié)果和分析

2.1 HAM23-like的克隆

以向日葵總RNA反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板,用HAM23-likeF/R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)測(cè)大小一致的條帶(圖1)。為了驗(yàn)證克隆準(zhǔn)確性,挑選10個(gè)單克隆菌落進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序片段為956 bp，包含了HAM23-like基因完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)。

2.2 HAM23-like的生物信息學(xué)分析

從NCBI中BLAST比對(duì)找到HAM23-like基因的序列，再通過(guò)NCBI的CD Search搜索HAM23-like基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明HAM23-like的ORF為831 bp(圖2)，編碼276個(gè)氨基酸。該基因編碼的蛋白具有保守的MADS-box和K-box結(jié)構(gòu)域,分別位于氨基酸序列的第46～119和128～211位(圖3)。利用在線分析網(wǎng)站ExPASy對(duì)HAM23-like蛋白進(jìn)行組分分析，相對(duì)分子質(zhì)量為30.52 kD，理論等電點(diǎn)為9.42，屬于不穩(wěn)定蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)為55.03；脂溶性指數(shù)為76.03；親水性平均值(GRAVY)為-0.683。蛋白中包括正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)46個(gè)，負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)35個(gè)，分別占總氨基酸數(shù)的16.7%和12.7%。疏水性最強(qiáng)和親水性最強(qiáng)的氨基酸分別是位于第91位的Ile(1.944)和264 位的 His(-3.778)(圖 4)。

圖1 HAM23-like的擴(kuò)增。M：DL2000 DNA Marker。Fig.1 PCR of HAM23-like.MDL2000 DNAMarker.

將推測(cè)的向日葵HAM23-like基因與其他植物MADS-box基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì),結(jié)果表明HAM23-like具有典型MADS-box保守結(jié)構(gòu)域，即MIKC結(jié)構(gòu)域。隨后構(gòu)建了基于MADS-box基因編碼氨基酸序列的擬南芥和向日葵系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5)，包括9個(gè)已報(bào)道的向日葵MADS-box氨基酸序列和本研究挑選出的8個(gè)疑似與花發(fā)育相關(guān)的MADS-box氨基酸序列。結(jié)果表明，HAM23-like蛋白與擬南芥的AGL18蛋白聚在同一分支上，說(shuō)明兩者有較高的親緣關(guān)系。

將HAM23-like基因與擬南芥Agamous-like 18、朝鮮薊、萵苣和番茄的MADS-box transcription factor 23-like基因等編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果表明(圖6)，HAM23-like在第46～119位有典型的MADS-box保守結(jié)構(gòu)域,擬南芥AGL18蛋白和朝鮮薊、萵苣及番茄的MADS-box transcription factor 23-like蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分別位于第2～75、2～74、43～115和 2～77位，說(shuō)明 MADS-box蛋白的保守結(jié)構(gòu)域具有高度相似性。同時(shí)，HAM23-like與朝鮮薊的MADS-box transcription factor 23-like相似度最高，達(dá)到81%；可能向日葵與擬南芥屬于不同科,存在一定的差異，與擬南芥的AGL18的相似度不高。

2.3 HAM23-like的表達(dá)分析

圖2 HAM23-like基因序列和編碼的氨基酸序列Fig.2 Sequence of HAM23-like and encoded amino acid sequence

圖3 HAM23-like蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conversed domain of HAM23-like protein

圖4 HAM23-like蛋白的親、疏水性預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of hydrophobicity and hydrophilicity of HAM23-like protein

圖5 擬南芥和向日葵MADS-box蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。A：擬南芥；c：向日葵。Fig.5 Phylogenetic tree of MADS-box proteins in Arabidopsis and Helianthus.A：Arabidopsis thaliana；c：Helianthus annuus.

圖6 向日葵HAM23-like的氨基酸序列與其他植物的同源性比較Fig.6 Homology comparison of Helianthus annuus HAM23-like protein with other plants

圖7 HAM23-like在不同組織中的表達(dá)Fig.7 Expression of HAM23-like in different tissues

組織表達(dá)模式分析結(jié)果表明(圖7)，HAM23-like基因在向日葵的根、莖、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)，在花的表達(dá)量最高，其次是果實(shí)，莖中的表達(dá)量最低。HAM23-like基因在花中的最高表達(dá)量達(dá)到了莖中表達(dá)量的24倍。這說(shuō)明HAM23-like可能在花發(fā)育和果實(shí)的形成過(guò)程中起重要的作用。

對(duì)花發(fā)育6個(gè)時(shí)期(-35至0 d)和果實(shí)發(fā)育早期(5 d，未成熟果實(shí))及開(kāi)花當(dāng)天的6個(gè)花器官中HAM23-like基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明(圖8)，花發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中，HAM23-like基因的表達(dá)量逐漸升高，尤其在開(kāi)放前5 d(-5 d)表達(dá)量激增,并在完全開(kāi)放時(shí)達(dá)花期最高值，在果實(shí)發(fā)育早期HAM23-like基因表達(dá)達(dá)到整個(gè)生命周期的峰值,這表明HAM23-like可能在向日葵開(kāi)花過(guò)程和果實(shí)發(fā)育早期發(fā)揮重要的調(diào)控作用。同時(shí)，在開(kāi)花當(dāng)天,HAM 23-like在雄蕊和子房有表達(dá)，且雄蕊中的表達(dá)量極高，這說(shuō)明HAM 23-like可能對(duì)雄蕊和花粉的形成起重要的調(diào)控作用,也對(duì)果實(shí)早期的形成有著一定的影響。

3 討論

高等植物生活周期史中，生殖發(fā)育或花發(fā)育是極其重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，受到遺傳因素和外界環(huán)境的雙重影響，是開(kāi)花基因在時(shí)間和空間順序上的表達(dá)與外部環(huán)境的影響共同作用的結(jié)果[19-20]。植物花發(fā)育進(jìn)程涉及到光周期、春化、自主和赤霉素等信號(hào)途徑[21]。此外，MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用也是該進(jìn)程不可或缺的因素[22]。然而，MADS-box家族對(duì)植物生長(zhǎng)的調(diào)控作用體現(xiàn)在多個(gè)方面，不僅參與花分生組織的發(fā)生和花器官形態(tài)建成的調(diào)節(jié)[23]，還與控制開(kāi)花時(shí)間[24-31]、調(diào)節(jié)側(cè)根生長(zhǎng)[32]、果實(shí)、胚珠和種皮的形成有關(guān)[33-37]。

圖8 HAM23-like在不同開(kāi)花時(shí)間和不同花器官的表達(dá)量Fig.8 Expression of HAM23-like in different flowering day and floral organs

本研究從向日葵中克隆了1個(gè)MADS-box基因HAM 23-like，對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同源對(duì)比結(jié)果表明HAM 23-like具有典型的MADS-box保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析表明HAM 23-like與擬南芥的AGL18親緣關(guān)系最近。有研究表明；AGL18參與擬南芥花器官發(fā)育和角果發(fā)育的調(diào)控；過(guò)表達(dá)AGL18會(huì)延長(zhǎng)生長(zhǎng)周期和花器官的衰老和脫落，抑制開(kāi)花[23]。因此，我們推測(cè)向日葵HAM23-like基因作為AGL18的同源基因也可能參與花發(fā)育進(jìn)程調(diào)控。AGL18基因在擬南芥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期幾乎所有部位有表達(dá)，僅新生葉片和下胚軸中沒(méi)有表達(dá)；在生殖生長(zhǎng)期從未成熟的花蕾到花粉和種皮均可表達(dá)，且其在根、花和角果中的表達(dá)量較高[23]。本研究結(jié)果表明，HAM23-like基因在向日葵的根、莖、葉、花和瘦果中均有表達(dá)，以花和瘦果的表達(dá)較高，這與AGL18基因在擬南芥的表達(dá)模式較為相似。這進(jìn)一步說(shuō)明HAM23-like基因?yàn)锳GL18的同源基因，也暗示HAM23-like基因可能具有與AGL18基因相似的功能，參與調(diào)控向日葵花的形成和開(kāi)放，而調(diào)控方式和調(diào)控部位是否相同還有待于進(jìn)一步研究。

目前，擬南芥和水稻中分別報(bào)道了MADS-box基因107和75個(gè)[38-43]，而有關(guān)向日葵的MADS-box基因報(bào)道卻很少。HAM75和HAM92對(duì)花瓣和種皮的形成有影響[17]，HAM59和HAM45共同確定雄蕊和雌蕊的形成[18]。但還未見(jiàn)能同時(shí)影響雄蕊和果實(shí)形成的MADS-box基因。HAM 23-like在花發(fā)育過(guò)程各階段均有表達(dá)，以開(kāi)花前5 d、開(kāi)花當(dāng)天和開(kāi)花后5 d的表達(dá)量相對(duì)較高，且HAM 23-like僅在雄蕊和子房中表達(dá)，雄蕊的表達(dá)量遠(yuǎn)高于子房。在擬南芥中AGL18基因未成熟的花蕾、花粉，角果和種皮均具有較高的表達(dá)水平[23]。說(shuō)明向日葵HAM23-like基因也具有擬南芥AGL18基因相似的生物學(xué)功能，主要與花發(fā)育后期的花器官和花粉發(fā)育以及瘦果和種皮早期發(fā)育有緊密聯(lián)系。然而該基因是否在花開(kāi)放和果實(shí)形成過(guò)程中起到?jīng)Q定作用還不清楚,而且HAM23-like基因是否和AGL18基因一樣對(duì)向日葵花器官發(fā)育發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用也需要進(jìn)一步的驗(yàn)證[23,44]。

本研究對(duì)HAM23-like基因及其編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測(cè)和分析，以及對(duì)該基因在向日葵組織表達(dá)的特性進(jìn)行定量分析，為探究HAM23-like基因在向日葵花發(fā)育過(guò)程的調(diào)控作用提供科學(xué)依據(jù)。