綿羊鮮精低溫保存及應(yīng)用技術(shù)研究

肖廣慶，劉新偉，李恒帥，侯玉武（河南省洛陽市畜牧良種繁育推廣中心，河南 洛陽 471013）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)器材

相差顯微鏡（OLYMPUS,日本），密度儀（IMV，法國），水浴鍋，數(shù)控冰箱，泡沫盒，度計(jì),假陰道，保定架，輸精槍。

1.1.2 鮮精及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源

供精羊?yàn)槁尻柺行竽亮挤N繁育推廣中心羊場的4頭杜泊羊，4頭澳洲白和3頭純種薩?？搜蚍N公羊。實(shí)驗(yàn)羊來自新安縣三森牧業(yè)有限公司湖羊。

1.1.3 鮮精低溫保存稀釋液配方：

短期保存液(3 d，以下稱 D液)：Tris 3.18 g，果糖0.68 g，葡萄糖0.38 g，檸檬酸1.88 g。加蒸餾水100 mL，加卵黃20 mL。用前還要在已配好的稀釋液里每毫升加青霉素和連霉素各1000國際單位。

長期保存液（13 d，以下稱C液）：D液每100 mL加入防腐劑 （食品添加劑）0.05 g，VE 5 mg，EDTA 0.1 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)一：綿羊精液短期（3 d）保存活力衰減實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^該實(shí)驗(yàn)了解鮮精稀釋后存放溫度對活力的影響，找出最佳存放及運(yùn)輸保存方式。實(shí)驗(yàn)方法：羊采精后馬上用D稀釋液稀釋，然后分別放在室溫（常溫空調(diào)（15℃～25℃）、冰箱冷藏（0℃～4℃），泡沫盒放冰袋（0℃～8℃））保存，觀察活力情況。為減少原精活力差別，采用同只羊精液稀釋后三等分標(biāo)注A/B/C分別存放。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)二：不同品種綿羊精液相同保存狀態(tài)活力衰減實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^該實(shí)驗(yàn)了解羊鮮精用相同稀釋液稀釋后在相同保存狀態(tài)下，不同品種間鮮精保存活力影響差異。實(shí)驗(yàn)方法：不同品種羊精液用同種稀釋液稀釋，放置冰箱冷藏（0℃～4℃）保存，觀察活力情況。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)三：長期保存稀釋液稀釋存放時(shí)間實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模河^察長效稀釋液在低溫存放狀態(tài)下最長保存時(shí)間及品種間差異性。實(shí)驗(yàn)方法：不同品種綿羊精液用C稀釋液稀釋后放置在冰箱冷藏（0℃～4℃）保存，觀察活力衰減及品種間差異。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)四：綿羊鮮精低溫保存不同存放時(shí)間受胎率實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模乎r精低溫保存目的在于其配種后的受精能力是否受影響，通過該實(shí)驗(yàn)了解羊鮮精低溫保存時(shí)間對受胎率的影響，從而為實(shí)際生產(chǎn)提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法：在新安縣三森牧業(yè)有限公司羊場挑選90日齡母羊，經(jīng)同期發(fā)情處理，用低溫存放1 d、2 d、3 d的鮮精輸精，采用常規(guī)陰道（子宮頸口）輸精方式，40 d后B超檢查受胎情況。

1.2.5 保存狀態(tài)及精液檢測

冰箱存放：鮮精稀釋后，把盛有精液的集精杯放入試管架浸泡水中再放入冰箱（達(dá)到緩慢降溫），冰箱溫度用溫度計(jì)校準(zhǔn)后使用。冰袋泡沫盒保存：用壁厚2～3 cm泡沫盒，體積適中，冰袋與精液透氣隔開，密封保存。室溫保存：用泡沫盒密封保存?？照{(diào)溫度設(shè)置25℃。所有保存方式用溫度計(jì)測試溫度并記錄。活力觀察：用相差顯微鏡，在400倍顯微鏡下評定鮮精活力，顯微鏡載物臺的溫度應(yīng)保持在38℃～40℃，共選取3個(gè)以上視野評估。每4 h觀察一次。密度：取原精10 μL，用0.9%生理鹽水稀釋400倍，放入密度儀中直接讀取。稀釋倍數(shù)：均按1：3倍稀釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)一

綿羊精液短期（3 d）保存活力衰減實(shí)驗(yàn)。2018年3月16日選取洛陽市畜牧良種繁育推廣中心種羊場杜泊羊DB16102采精，連續(xù)兩次采精，射精量2.4 mL，等分3份，每份0.8 mL，原精活力91.56%±0.23%，密度36.23±0.5億，用D稀釋液1：3倍稀釋后保存如表1。

表1 不同狀態(tài)鮮精保存活力情況表

結(jié)論：同一只羊，相同稀釋液及稀釋比例，在冰箱或冰袋存放狀態(tài)下活力差異不顯著。3 d活力衰減分別為3.5%、4.4%，經(jīng)10次重復(fù)試驗(yàn)，活力衰減在5%以內(nèi)，冰箱或冰袋存放差異不顯著（P＞0.05）。常溫存放（最好2 h之內(nèi)用完，適合現(xiàn)配現(xiàn)用），最長8 h，最短6 h，與原精活力有關(guān)，原精活力好存放時(shí)間長，原精活力差存放時(shí)間短。

2.2 實(shí)驗(yàn)二

不同品種綿羊精液相同保存狀態(tài)活力衰減實(shí)驗(yàn)。2018年3月22日，挑選洛陽市畜牧良種繁育推廣中心種羊場杜粕羊、澳洲白、薩福特原精活力較好（80%）以上的，用D稀釋液1：3倍稀釋后分品種混合,放冰箱冷藏（0℃～4℃）保存，見表 2。

表2 不同品種綿羊冰箱冷藏保存3 d活力實(shí)驗(yàn)

結(jié)論：品種間相同稀釋液冰箱冷藏存放，3 d活力衰減分別是4.2%、3.6%、3.6%，品種間活力衰減差異不顯著(P＞0.05），均在 5%以內(nèi)。

2.3 實(shí)驗(yàn)三

長期保存稀釋液稀釋存放時(shí)間實(shí)驗(yàn)。2018年8月22日，把同品種羊精液（80%）以上活力用C稀釋液1：3倍稀釋后混合，冰箱冷藏（0℃～4℃）保存，結(jié)果見表3。

表3 不同品種綿羊鮮精冷藏狀態(tài)下存放時(shí)間實(shí)驗(yàn)

結(jié)論：在冷藏條件下，長效稀釋液最長可保存13 d（活力達(dá)到0.35以上），第14 d快速衰竭至0。在當(dāng)今物流條件下，由于公羊站3 d之內(nèi)供精可輻射國內(nèi)任何以地區(qū)，所以，長效保存僅限于理論研究。可為偏遠(yuǎn)地區(qū)如西藏、新疆等地提供理論支持。

2.4 實(shí)驗(yàn)四

綿羊鮮精低溫保存不同存放時(shí)間受胎率實(shí)驗(yàn)。2018年8月在新安縣三森牧業(yè)有限公司選擇舍飼湖羊待配母羊90只,中等膘情，30只一圈分別為A、B、C三圈。分別用1 d、2 d、3 d存放鮮精配種。

把A、B、C三圈羊分別于 2018年8月 15、16、17日上午放置進(jìn)口海綿栓，第13 d（27日/28日/29日）上午撤栓打針，每只注射300單位孕馬血清，第15 d（29/30/31日）上午輸精。第14 d（8月28日）上午采精，用D稀釋液1：3稀釋后放冰箱冷藏保存。輸精量每只母羊輸鮮0.2 mL一次，2次輸精。90頭份共需鮮精36 mL（30頭份12 mL一試管A/B/C分開保存）。輸精時(shí)取出鮮精33℃水浴存放。具體情況見表4。

表4 綿羊鮮精保存時(shí)間長短受胎率實(shí)驗(yàn)

由表2可見，精液低溫保存活力衰減較低，但受胎率差異顯著(P＜0.05）。鮮精冷藏24 h受胎率＞鮮精冷藏48 h＞鮮精冷藏72 h。其中鮮精冷藏1 d與第2 d受胎率減少6.7%，存在顯著差異（P＜0.05）；第1 d與第3 d受胎率減少16.7%，存在極顯著差異（P＜0.01）。說明精液低溫保存時(shí)間對受胎率有一定的影響，盡量縮短保存時(shí)間。用低溫保存后的鮮精做人工輸精，雖然返情率較高,但排除人工授精和同期發(fā)情不利因素，總體看效果還是令人滿意的。

3 討 論

近年來我國養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展迅速，規(guī)模養(yǎng)殖蓬勃發(fā)展，但羊人工授精技術(shù)相對滯后。尤其是在我國綿羊凍精生產(chǎn)與應(yīng)用技術(shù)還不十分成熟的情況下,廣泛推廣羊鮮精低溫保存技術(shù)，為羊人工授精技術(shù)推廣、種公羊站建設(shè)推廣提供技術(shù)支撐，從而提高優(yōu)秀種公羊利用效率，降低種羊場飼養(yǎng)種公羊費(fèi)用，提高良種覆蓋率及改良效果。

羊人工授精受胎率受精液活力、人工授精技術(shù)、羊發(fā)情鑒定技術(shù)、羊同期發(fā)情技術(shù)、飼養(yǎng)管理技術(shù)等影響，需要逐步進(jìn)行規(guī)范研究，制定相關(guān)技術(shù)規(guī)范，才能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定提高的目的。