老年帶狀皰疹后神經痛病人外周血Th17/Treg細胞及相關細胞因子的表達*

陳曉彤 王 蕊 常 敏 孫明潔 王 昕 于 洋 王清義 陳付強△

（1濟寧醫(yī)學院，濟寧272067；2青島市市立醫(yī)院疼痛科，青島市疼痛臨床研究治療中心，青島266011；3青島市婦女兒童醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護室，青島266011）

帶狀皰疹后神經痛 (postherpetic neuralgia, PHN)定義為帶狀皰疹 (herpes zoster, HZ) 皮疹愈合后持續(xù)1個月及以上的疼痛[1]，是帶狀皰疹最常見的并發(fā)癥[2]。PHN是最常見的一種神經病理性疼痛，可表現為持續(xù)性疼痛,也可緩解一段時間后再次出現[3]。PHN的發(fā)生隨年齡的增加而增加[4,5]，病人可因長期慢性疼痛而導致抑郁，甚至自殺，這給老年人的晚年生活健康蒙上陰影。因為PHN的發(fā)病機制尚不明確，無法用單一原因解釋其發(fā)生，所以針對PHN這種典型的神經病理性疼痛目前還沒有有效、快速的治療方法。研究表明PHN的發(fā)生與機體細胞免疫紊亂、被異常抑制相關[6,7]，Treg細胞屬于輔助性T淋巴細胞，是一類特異性表達叉頭狀轉錄因子或翅膀狀螺旋轉錄因子(fork head box P3, Foxp3)具有主動抑制效應的T細胞(effector T cells)，發(fā)揮免疫抑制、維持免疫耐受[8]，是發(fā)揮免疫負調控功能主要的T淋巴細胞亞群。Th17細胞是一類介導炎癥反應的T細胞亞群，可以刺激多種炎性因子的合成，誘導局部炎癥反應，調節(jié)體液免疫中抗體的合成。Th17及Treg細胞及其相關細胞因子在免疫性疾病、腫瘤、感染性疾病等多種疾病中起到重要作用［9～12］。同時，兩種細胞在各自分化、對免疫系統(tǒng)功能的調節(jié)方面既密切聯系，又相互制約。Luchting等對26名患有神經性疼痛病人的T細胞亞群的一項研究發(fā)現，與健康對照組相比，神經性疼痛病人存在TH17/Treg失衡，表現為抗炎性Treg細胞增加，促炎性Th17細胞減少[13]，然而國內對此兩種細胞及其相關細胞因子是否參與PHN的機制研究較少，因此本研究檢測老年PHN病人外周血中Th17/Treg細胞及相關細胞因子的表達水平，旨在探討Th17/Treg細胞在PHN病程中的作用機制，以期對臨床診治提供新的研究方向和可靠的實驗依據。

方 法

1.一般資料

本研究符合本單位的倫理學標準并得到批準，且已得到病人與家屬的知情同意，并與病人及家屬簽署知情同意書。

入選標準：符合PHN診斷標準，年齡≥65歲，視覺模擬評分(visual analogue scale, VAS) 均在7 分以上，言語上無障礙，能夠理解、接受VAS評估，無嚴重的內科疾病，在過去的一個月內，沒有使用糖皮質激素和免疫抑制劑，也沒有使用其它一些可影響T淋巴細胞亞群的藥物。

排除標準：伴有嚴重心、肺、腎等系統(tǒng)性疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病的病人和應用免疫抑制劑的病人，以及精神病病人或不合作者。

選取2017年3月至2018年3月山東省青島市市立醫(yī)院疼痛病房PHN病人60例，皮損及疼痛區(qū)域神經支配范圍 C3-L2, 左頭面部4例，右頭面部3例，左上肢5例，右上肢4例，左胸背部19例，右胸背14例，右腰臀部7例，左下肢2例，右下肢2例。年齡65～88歲，平均年齡73.7歲， VAS平均為8.62分，其中男26例，女34例。收集其入院時的血標本。健康對照組30例，為本院門診同期健康體檢者，年齡65～86歲，平均年齡73.4歲，男14例，女16例。病例組與對照組在性別、年齡等方面差異無統(tǒng)計學意義(P＞ 0.05)。

2.主要試劑及儀器

小鼠抗人單克隆抗體(CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5)、同型對照抗體以及抗人Foxp3-PE、 Foxp3固定破膜工作液：法國Immunotech公司；紅細胞裂解液(Optilyse C)法國Immunotech公司；人白介素6(IL-6)酶聯免疫吸附測定試劑盒、人白介素10 (IL-10)酶聯免疫吸附測定試劑盒、人白介素17 (IL-17)酶聯免疫吸附測定試劑盒、人白介素35 (IL-35)酶聯免疫吸附測定試劑盒、人腫瘤壞死因子(TNF-α)酶聯免疫吸附測定試劑盒：大連寶生物工程有限公司；流 式 細 胞 儀 (Epics XL·MCL)： 美 國 BECKMAN COULTER公司；低溫高速離心機：德國Heraeus公司；37℃恒溫箱：北京福意電器有限公司；Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數儀。

3.方法

標本收集：無菌條件下采集病例組和對照組清晨空腹靜脈血8 ml，5 ml置于肝素鈉抗凝管中，加入等體積PBS稀釋后采用人淋巴細胞分離液密度梯度離心法獲取外周血單個核淋巴細胞。另3 ml置于干燥管中，室溫靜置1 h，3 500 rpm離心5 min，獲取血清，貯存于-70℃ 冰箱中保存，用于后續(xù)ELISA檢測。

血清細胞因子檢測：空白孔中加標準品和樣品稀釋液100 μl，余孔中加標準品或待測樣品100 μl，混勻，覆膜，37℃孵育90 min，用洗滌液洗滌檢測板3次，每次均用吸水紙拍干；每孔加酶結合物工作液100 μl，覆膜，37℃孵育60 min；用洗滌液洗滌檢測板5次，吸水紙拍干；每孔加底物溶液90 μl，酶標板加上覆膜37℃避光孵育15 min；每孔加終止液50 μl，混勻；用450 nm波長讀取吸收值，繪制標準曲線。

Treg細胞檢測：單個核淋巴細胞PBS重懸，調節(jié)PBMC濃度為1×106個/ml左右。每管加入200 μl制備好的單個核細胞懸液及20 μl CD4-FITC/CD25-PE混合液，4℃避光孵育30 min；經流式染色緩沖液洗滌后，加入1 ml Fixation/Permeabilization 破膜緩沖液，4℃避光孵育45 min；用破膜緩沖液洗滌2次，加入20 μl Foxp3-PE-Cy5（同型對照管加入20 μl IgG2a-PE-Cy5），4℃避光孵育30 min；經破膜緩沖液洗滌2次，用500 μl流式染色緩沖液重懸，上機檢測，熒光數據的獲得以熒光強度＞ 3 000個個體細胞為陽性,結果最終以每個細胞的平均熒光強度表示。

Th17細胞檢測：單個核淋巴細胞PBS重懸，調節(jié)PBMC濃度為1×106個/ml左右。其后按流式檢測試劑盒說明書操作，依次加入固定液、破膜劑，抗體混合液，每種試劑加入后均按說明進行避光，孵育、離心，洗滌。用500 μl流式染色緩沖液重懸，上機檢測，熒光數據的獲得以熒光強度 ＞ 3 000個個體細胞為陽性,結果最終以每個細胞的平均熒光強度表示。

4.統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，數據以均數±標準差(±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.老年PHN病人外周血中Th17細胞百分比降低、Treg細胞百分比升高及Th17/Treg比值降低

老年PHN組Th17細胞表達(0.46±0.48)%、對照組(0.67±0.79)%；老年PHN組Treg細胞表達(3.62±1.25)%、對照組(1.31±1.04)%；老年PHN組Th17細胞百分比顯著降低，Treg細胞百分比顯著升高，Th17/Treg比值顯著降低，說明老年PHN病人存在Th17/Treg比例失衡現象（見表1）。圖 1為對照組與老年PHN病人外周血Treg細胞的流式細胞結果圖。圖 2 為對照組與老年PHN病人外周血Th17細胞的流式細胞結果圖。

表1 老年PHN病人與對照組外周血Th17及Treg細胞的百分比及Th17/Treg比率結果(±SD)Table 1 Frequency of Th17，Treg and Th17/Treg ratio at elder patients with PHN (±SD)

表1 老年PHN病人與對照組外周血Th17及Treg細胞的百分比及Th17/Treg比率結果(±SD)Table 1 Frequency of Th17，Treg and Th17/Treg ratio at elder patients with PHN (±SD)

*P ＜ 0.05，與對照組相比 *P ＜ 0.05，compared with control group.

組別Group 例數Number CD4+IL-17+ CD4+CD25+Foxp3+ Th17/Treg對照組Control 30 0.67±0.79 1.31±1.04 45.63±0.28病例組Patient 60 0.46±0.48* 3.62±1.25* 23.18±0.23*

2.老年PHN病人血清中IL-6、IL-17降低，IL-10、TNF-α升高

首先繪制標準曲線，標準品終濃度分別為0、50、100、250、500、1000 pg/ml，曲線擬合適配度(R Square)均在95%以上（見圖3）。與對照組相比，老年PHN病人血清中IL-6、IL-17的水平顯著降低(3.36±0.48vs.5.57±0.79、2.43±0.28vs.4.18±0.23,P＜ 0.05)，IL-10、TNF-α 水平顯著升高（5.34±1.25vs.2.38±1.04、5.41±3.22vs.2.56±1.24，P＜ 0.05，見圖 4）。

討 論

PHN往往表現為持續(xù)而劇烈的燒灼樣痛或間斷性電擊樣疼痛，同時伴隨多種感覺異?；蛉笔В呖梢远虝旱臏p輕疼痛的強度，但情緒激動，環(huán)境溫度的升高，以及勞累都會加重疼痛的強度，嚴重妨礙了病人機體功能狀態(tài)，同時也降低了病人生活的質量，老年人尤為嚴重。研究表明PHN的發(fā)生與機體細胞免疫功能紊亂、被異常抑制有關[14,15]。

Treg是一種具有免疫抑制活性的CD4+T細胞亞群，Treg通過釋放細胞因子IL-10和TNF-α發(fā)揮抑制T細胞及抗原呈遞細胞的功能，上調抑制性免疫細胞表面分子表達和下調活化T細胞的相關基因表達，發(fā)揮免疫調節(jié)作用，維持免疫耐受，預防自身免疫性疾病的發(fā)生。Th17細胞是一種介導炎癥反應的CD4+T細胞亞群，Th17細胞通過分泌炎性細胞因子IL-17等，可對體內中性粒細胞的活化、動員起到介導作用，促進機體的炎癥反應，與多種自身免疫性疾病的發(fā)生關系密切。Th17細胞 和Treg細胞在功能上相互拮抗，在分化發(fā)育過程中密切相關[16]，即機體在免疫穩(wěn)定時，免疫系統(tǒng)產生的TNF-α抑制效應T細胞生成，促進Foxp3+Treg分化，維持自身耐受[17]；在感染或炎癥浸潤時，激活的固有免疫系統(tǒng)產生IL-6促進Th17細胞誘導的炎癥反應，并抑制TNF-α介導的Treg細胞生成[18]。Th17/Treg細胞保持動態(tài)平衡，在機體免疫防御、免疫穩(wěn)定維護中發(fā)揮重要作用。 促炎性Th17細胞與抑制性Treg細胞的比例失衡是很多炎癥及自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展的一個關鍵因素。

圖1 對照組與老年PHN病人外周血Treg細胞的流式細胞結果圖Fig.1 The flow cytometric histogram of elderly patients with PHN and healthy control Treg staining

圖2 對照組與老年PHN病人外周血Th17細胞的流式細胞結果圖Fig.2 The flow cytometric histogram of elderly patients with PHN and healthy control Treg staining

圖3 四種細胞因子的標準曲線圖Fig.3 Standard curves of four kinds of fl ow cytokines

圖4 老年PHN病人與健康對照組IL-6, IL-10, IL-17,TNF-α的水平(pg/ml,±SD)Fig.4 Expression of IL-6, IL-10, IL-17, TNF-α in elderly patients with PHN and healthy control (pg/ml,±SD)*P ＜ 0.05，與對照組相比；*P ＜ 0.05，compared with control group.

本研究以老年PHN病人為研究對象，檢測病人外周血中Th17、 Treg細胞及其相關細胞因子的表達水平，探討其病程中此兩種細胞是否存在數量變化及失衡情況。結果顯示，外周血中 CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的比例升高，其相關細胞因子IL-10、TNF-α也相應升高，由此推測，VZV感染機體可誘導Treg細胞活化、增殖，及分泌抑制性細胞因子TNF-α，抑制機體的抗病毒免疫應。老年PHN 病人體內由于CD4+CD25+Treg 表達量增高，免疫抑制功能增強，引起特異性細胞免疫，下調機體抗病毒免疫反應,這在PHN發(fā)病機制中起著重要作用。本小組前期研究發(fā)現老年PHN病人較健康對照者外周血中CD4下降，CD4/CD8下降，Treg表達增高，且PHN的嚴重程度和Treg表達呈正相關[15]。Ahmad Bayat等研究表明PHN病人外周血中存在抗干擾素 α (IFN-α)、抗干擾素 γ (IFN-γ)、及抗IL-6的自身抗體，并且以上抗體水平均較正常人增高[19]；Luchting等[13]研究發(fā)現，神經性疼痛病人存在TH17/Treg失衡，表現為抗炎性Treg細胞增加，促炎性Th17細胞減少，Treg相關的FoxP3和TGF-βmRNA表達升高，而Th17相關的RORγT的表達降低，但細胞因子IL-6、IL-10和IL-17與健康對照組相比并無明顯差異。本研究結果表明，Th17細胞在老年PHN病人的外周血中低表達，促進其分化的IL-6及其分泌的IL-17 相應降低，可能的原因是老年PHN病人TNF-α顯著升高，而高水平的TNF-α可以誘導Treg細胞的生成，而增高的 Treg有可能抑制Th17細胞的分化，從而發(fā)揮免疫抑制作用。由此得出：Th17細胞及Treg細胞在免疫調節(jié)功能中互相拮抗與制約，兩者平衡狀態(tài)決定了疾病的發(fā)展方向，而Th17/Treg細胞比率失衡可能是老年 PHN病人病程遷延不愈的一個重要原因。

綜上所述，機體免疫組織、免疫細胞和免疫分子構成一個復雜的免疫調節(jié)機制，而Th17和Treg細胞在其中起著重要的調節(jié)作用。Th17/Treg細胞比率失衡在 PHN 疾病進展中起重要作用，但PHN時T淋巴細胞亞群間究竟如何相互作用尚不清楚，Th17 是否通過轉錄因子IL-6-RORγt、STAT3的介導和相關細胞因子間的相互作用使細胞的信號轉導通路發(fā)生改變，進而作用于靶器官，影響Th17細胞與Treg的分化和表達，改變機體的免疫平衡狀態(tài)，導致免疫抑制改變，還需要我們更進一步的闡明。