KBN觸變凝膠劑對非感染性炎癥模型動物的抗炎作用及機制研究

黃祖波， 沈崇坤， 馮會婷， 侯雪楠， 吳文如， 張軍

（1.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣東廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學附屬中山中醫(yī)院，廣東中山 528400；4.廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510006）

KBN觸變凝膠劑[1]是本課題組立足于“優(yōu)化處方，優(yōu)化劑型”對治療外陰陰道假絲酵母菌?。╲ulvovaginal candidiasis，VVC）的中藥新藥開展持續(xù)研究而獲得的一種新型中藥制劑。該制劑由黃連、三白草、雞冠花、大青葉、苦參、百部、龍膽、香薷、丁香、冰片10味中藥材組成，具有清熱解毒、祛濕止帶、殺蟲止癢之功，臨床用于治療霉菌性陰道炎。前期研究已證實該制劑具備優(yōu)良的抑殺白色念珠菌功效，但其抗炎效果及作用機制尚不明確?？寡鬃饔檬切滤幩幮W評價的重要組成內容?；诖耍狙芯繑M通過建立大鼠足腫脹模型及小鼠急性耳腫脹模型，評價KBN觸變凝膠劑的抗炎作用，并從核因子kappaB（NF-κB）信號通路調控局部組織中炎癥相關蛋白和因子的表達水平，初步探討其作用機制，以期為KBN觸變凝膠劑的臨床開發(fā)應用提供科學依據，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD雌性大鼠，180～220 g，SPF級KM雌性小鼠，18～22 g，均由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2013-0034。

1.2 藥物及試劑 凝膠基質KBN觸變凝膠劑為南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院中試研究制備產品；地塞米松（華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號：1802013H）。角叉菜膠（美國Sigma公司，批號：SLBR0530V）；大鼠血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20180619、20180616）；RIPA Lysis Buffer（CWBIO公司，批號：01408/40313）；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗鼠抗兔二抗（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號：77K00113）；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（聯(lián)科生物，批號：71708373）；核因子NF-κB p65抗體（批號：AF5006）、抑制因子 IκB-α 抗體（批號：AF5002）、COX-2抗體（批號：AF7003）、Tubulin抗體（批號：AF7010）、GAPDH抗體（批號：AF7021）均購自于美國Affinity公司；水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20140412）；二甲苯（天津市富宇精細化工有限公司，批號：20160201-2）；4%多聚甲醛（合肥biosharp公司，批號：1807949）；OCT包埋劑（日本Sakura公司，批號：4583）；EDTA（pH9.0）抗原修復液（武漢Servicebio公司，批號：G1203）；DAB顯色劑組化試劑盒（武漢Servicebio公司，批號：G1211）。

1.3 儀器 PV-200型足容積測定儀（成都泰盟軟件有限公司）；KOC-220HR型低溫冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司）；酶標儀（美國PerKinElmer公司）；電泳儀、濕法電轉裝置、化學發(fā)光儀（美國Bio-Rad公司）；ZD-8800型水平脫色搖床（華利達實驗儀器公司）；勻漿機（美國Sonics公司）；PB-303N型電子天平（美國Mettler-Toledo公司）；老皮匠牌6 mm耳片打孔沖頭；微量進樣器（上海高鴿工貿有限公司）；PB-303N型電子天平（美國METTLER TOLEDO公司）；JJ-12J型脫水機、JBP5型包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；XSP-C204型顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）。

1.4 抗大鼠足跖腫脹實驗 參照文獻[2，3]方法，將60只大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為空白組、模型組（涂抹凝膠基質）、地塞米松組（涂抹復方醋酸地塞米松乳膏），KBN低、中、高劑量組（涂抹KBN觸變凝膠劑，生藥質量濃度分別為0.1、0.2、0.4 g·mL-1）。實驗時，將各組大鼠右后肢外側脫毛處理后，空白組不作任何處理，其他各組右后下肢外側涂抹相應的藥物。給藥后用醫(yī)用膠布覆蓋1 h，每天3次，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，使用足容積測定儀測量每只大鼠右后足正常足容積（V/mL）作為致炎前（0 h）數據，隨后將1%角叉菜膠（0.1 mL/只）注入大鼠右后足腳墊皮下，再分別測量致炎后0.5、1、2、3、4、6 h大鼠右后足容積。致炎6 h完畢后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（劑量：0.3 mL/100 g體質量），腹主動脈取血，分離血清，剝離足部致炎部位軟組織，樣本于-80℃保存?zhèn)溆?。按以下公式計算各個時間點的足腫脹度：足腫脹度=致炎后足容積-致炎前足容積。

1.5 采用酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測足跖腫脹模型大鼠血清TNF-α、IL-1β含量 取足跖腫脹模型大鼠血清解凍后3 000 r·min-1離心30 s，具體操作步驟嚴格按照TNF-α、IL-1β檢測試劑盒說明書進行。

1.6 采用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測足跖腫脹模型大鼠足部軟組織 NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表達 稱取適量足跖腫脹模型大鼠足部軟組織，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白總濃度。取蛋白上樣量50 μg，以10%SDSPAGE后濕法轉膜，50 g/L脫脂牛奶封閉1.5 h，洗滌。加入兔抗鼠NF-κB p65（1∶1 000）、IκBα（1∶1 000）、 COX-2（1∶1 000）、 Tubulin（1∶5 000）、GAPDH（1∶5 000）多克隆抗體，并置于4℃振蕩孵育過夜。PBST洗滌3次，二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。PBST洗滌3次，HRP化學發(fā)光底物曝光，用化學發(fā)光儀檢測顯影并采集保存圖像數據，用Image Lab圖像分析軟件，分析條帶蛋白灰度值。

1.7 抗小鼠耳廓腫脹實驗 參照文獻[4]方法，取60只小鼠，稱質量后隨機分成6組，分組方法同“1.4”項。于每只小鼠右耳廓的內外兩面均勻涂搽對應藥物溶液約0.05 mL/20 g體質量，每天3次，連續(xù)7 d。末次給藥30 min后，用蒸餾水洗去右側耳廓藥液并拭干，吸取二甲苯40 μL均勻涂布于小鼠右耳兩面引起炎癥30 min。將小鼠斷頸處死，迅速剪下左、右兩耳，用直徑6 mm打孔沖頭于相同位置打下兩側圓形耳片，稱質量記錄后浸入40 g/L多聚甲醛固定48 h備用。

1.8 免疫組織化學法檢測小鼠耳廓組織中NF-κB p65及IκBα的表達 取耳片組織，梯度酒精脫水、透明，石蠟包埋，切片，然后進行抗原修復，血清封閉。加入抗體孵育：一抗為兔抗鼠NF-κB p65、IκBα多克隆抗體，稀釋濃度均為1∶100，二抗為HRP標記山羊抗兔IgG，稀釋濃度為1∶200。DAB顯色后復染細胞核，最后脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。圖像分析判讀：蘇木素染細胞核為藍色，DAB顯出的陽性表達為棕黃色，在高倍視野（40×10）的光鏡下，隨機選擇10個具有代表意義的視野，計算每個視野100個細胞中的陽性細胞（取均數），并觀察細胞顯色深淺。

1.9 統(tǒng)計方法 采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析。方差齊時，組內兩兩多重比較采用LSD檢驗；方差不齊時，組內兩兩多重比較采用Dunnett’s T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 KBN觸變凝膠劑對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響 表1結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠足容積隨時間逐步增大；造模后0.5～6 h，與模型組比較，KBN高劑量組大鼠足腫脹度降低（P＜0.05或P＜0.01），KBN低劑量和中劑量組有減小趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。KBN各劑量組足腫脹度與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明KBN觸變凝膠劑對角叉菜膠致大鼠足腫脹具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。

2.2 KBN觸變凝膠劑對足跖腫脹模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量的影響 表2結果顯示：與空白組比較，足跖腫脹模型組大鼠足部軟組織中TNF-α、IL-1β含量顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，KBN高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量顯著降低（P＜0.05），KBN中劑量組大鼠血清中IL-1β含量顯著降低（P＜0.05），KBN中劑量大鼠血清TNF-α含量及低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量有一定的降低趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明0.2～0.4 g·mL-1KBN觸變凝膠劑涂抹給藥能較好抑制角叉菜膠誘導的促炎因子釋放，且呈劑量依賴性。

表1 KBN觸變凝膠劑對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響Table 1 Effect of KBN thixotropic gel on carrageenan-induced paw edema in rats （±s，V/mL）

表1 KBN觸變凝膠劑對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響Table 1 Effect of KBN thixotropic gel on carrageenan-induced paw edema in rats （±s，V/mL）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

組別空白組模型組地塞米松組KBN低劑量組KBN中劑量組KBN高劑量組造模后6 h 0.00±0.02 1.04±0.31①0.79±0.14③1.01±0.14 0.98±0.10 0.89±0.16②足腫脹度0 h 000000造模后0.5 h 0.00±0.01 0.42±0.17①0.25±0.19③0.44±0.09 0.45±0.20 0.30±0.19②造模后1 h 0.00±0.02 0.69±0.32①0.43±0.16③0.65±0.13 0.68±0.25 0.51±0.20②造模后2 h 0.00±0.02 0.86±0.30①0.55±0.16③0.80±0.14 0.80±0.27 0.77±0.27②造模后3 h 0.01±0.02 0.98±0.31①0.67±0.18③0.88±0.16 0.91±0.22 0.79±0.26②造模后4 h 0.00±0.02 1.08±0.33①0.83±0.18③0.97±0.23 0.96±0.22 0.89±0.17②

表2 KBN觸變凝膠劑對足腫脹模型大鼠血清TNF-α、IL-1β含量的影響Table 2 Effect of KBN thixotropic gel on the expression of TNF-α and IL-1β in serum of paw edema rats[±s，ρ/（ng·L-1）]

表2 KBN觸變凝膠劑對足腫脹模型大鼠血清TNF-α、IL-1β含量的影響Table 2 Effect of KBN thixotropic gel on the expression of TNF-α and IL-1β in serum of paw edema rats[±s，ρ/（ng·L-1）]

①P＜0.01，與空白組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

IL-1β 61.75±19.97 245.37±66.86①111.74±39.86③163.01±77.90 152.65±34.77②149.85±43.75②組別空白組模型組地塞米松組KBN低劑量組KBN中劑量組KBN高劑量組N 10 10 10 10 10 10 TNF-α 29.0±3.20 155.91±16.37①117.16±17.50③143.84±27.50 130.81±15.68 123.56±17.23②

2.3 KBN觸變凝膠劑對足腫脹模型大鼠足部軟組織NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表達的影響 圖1、表3結果顯示：與空白組比較，角叉菜膠致足跖腫脹模型組大鼠足部軟組織中NF-κB p65、COX-2表達顯著增高（P＜0.05），IκBα表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，KBN高劑量組大鼠足部軟組織中NF-κB p65、COX-2表達顯著下降（P＜0.05或P ＜0.01）、IκBα表達顯著上升（P＜0.05），KBN中劑量和低劑量組NF-κB p65、COX-2表達有下降趨勢，IκBα表達有上升趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。KBN各劑量組大鼠足部軟組織NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表達與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明NF-κB/IκB信號通路可能介導了KBN觸變凝膠劑的抗炎作用，且呈劑量依賴性。

圖1 KBN觸變凝膠劑對足跖腫脹模型大鼠足部軟組織NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表達的影響Figure 1 Effect of KBN Thixotropic Gel on expression of NF-κB p65，IκBα and COX-2 in paw edema rats

表3 KBN觸變凝膠劑對足跖腫脹模型大鼠足部軟組織NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表達的影響Table 3 Effect of KBN thixotropic gel on expression of NF-κB p65，IκBα and COX-2 in paw edema rats （±s）

表3 KBN觸變凝膠劑對足跖腫脹模型大鼠足部軟組織NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表達的影響Table 3 Effect of KBN thixotropic gel on expression of NF-κB p65，IκBα and COX-2 in paw edema rats （±s）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

COX-2/GAPDH 0.123±0.021 0.918±0.048①0.665±0.197③0.860±0.101 0.857±0.115 0.715±0.085②組別空白組模型組地塞米松組KBN低劑量組KBN中劑量組KBN高劑量組N 10 10 10 10 10 10 NF-κB p65/GAPDH 0.233±0.025 0.803±0.059①0.400±0.092③0.640±0.099 0.600±0.027 0.503±0.084②IκBα/Tubulin 0.943±0.055 0.208±0.029①0.868±0.120③0.313±0.042 0.463±0.010 0.508±0.154②

2.4 KBN觸變凝膠劑對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 表4結果顯示：與空白組比較，模型組小鼠耳腫脹程度顯著增大（P＜0.05）；與模型組比較，KBN高劑量組小鼠耳廓腫脹程度降低（P＜0.05）。KBN各劑量組小鼠耳腫脹程度與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明KBN觸變凝膠劑對二甲苯所致的小鼠急性炎癥耳腫脹具有抑制作用。

表4 KBN觸變凝膠劑對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響Table 4 Effect of KBN thixotropic gel on ear edema degree of mice induced by dimethyl benzene （±s）

表4 KBN觸變凝膠劑對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響Table 4 Effect of KBN thixotropic gel on ear edema degree of mice induced by dimethyl benzene （±s）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

耳廓腫脹度（m/mg）0.233±0.224 6.167±1.905①0.533±0.312③5.189±2.504 4.233±1.973 3.900±1.491②組別空白組模型組地塞米松組KBN低劑量組KBN中劑量組KBN高劑量組N 10 10 10 10 10 10

2.5 KBN觸變凝膠劑對耳廓腫脹模型小鼠耳部組織中NF-κB p65及IκBα表達水平的影響 圖2、圖3、表5結果顯示：與空白組比較，模型組小鼠耳廓組織中NF-κB p65表達水平顯著增高（P＜0.05）、IκBα表達水平顯著降低（P ＜ 0.01）。與模型組比較，KBN高、中劑量組的小鼠耳廓組織中NF-κB p65表達水平顯著降低（P＜0.05），KBN低劑量組NF-κB p65表達有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，KBN高劑量組的小鼠耳廓組織中IκBα表達水平顯著增高（P＜0.05），KBN中、低劑量組IκBα表達亦有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；KBN各劑量組小鼠耳部組織NF-κB p65、IκBα表達與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明KBN觸變凝膠劑可降低局部炎癥組織中NF-κB p65的表達，上調IκBα的表達，從而達到抗炎效果，且呈劑量依賴性。

圖2 KBN觸變凝膠劑對耳廓腫脹模型小鼠耳組織NF-κB p65表達的影響（免疫組織化學法，×200）Figure 2 Effect of KBN thixotropic gel on the expression of NF-κB p65 in ear tissues of ear edema mice（by immunohistochemical method，×200）

圖3 KBN觸變凝膠劑對耳廓腫脹模型小鼠耳組織IκBα表達的影響（免疫組織化學法，×200）Figure 3 The effect of KBN thixotropic gel on the expression of IκBα in ear tissues of ear edema mice（by immunohistochemical method，×200）

3 討論

KBN觸變凝膠劑以“清熱解毒、利濕收斂、殺蟲止癢”遣藥組方，方中重用黃連，佐以龍膽、百部、苦參、丁香、大青葉等多味中藥材，黃連的用量達到其發(fā)揮體外抗菌最佳藥效的適宜量。臨床應用中，KBN觸變凝膠劑具有良好的抗炎消腫效果，能明顯改善婦科陰道炎、皮膚軟組織炎癥、接觸性皮膚炎等的炎癥癥狀。現(xiàn)代醫(yī)學表明，KBN觸變凝膠劑復方中一些活性成分具有明顯的抗炎作用，如小檗堿、丁香酚、黃芩苷、苦參堿等[5-8]。但KBN觸變凝膠劑在藥理實驗中具有的抗急性炎癥效果及抗炎機制尚不明確。

表5 各組小鼠耳廓組織中NF-κB p65及IκBα表達比較Table 5 Comparison of the expression levels of NF-κB p65 and IκBα in mouse ear tissues of various groups（±s，n/個）

表5 各組小鼠耳廓組織中NF-κB p65及IκBα表達比較Table 5 Comparison of the expression levels of NF-κB p65 and IκBα in mouse ear tissues of various groups（±s，n/個）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

IκBα陽性細胞數20.3±3.0 7.6±2.9①16.7±11.0③9.0±4.3 12.5±6.2 13.6±5.0②組別空白組模型組地塞米松組KBN低劑量組KBN中劑量組KBN高劑量組N 10 10 10 10 10 10 NF-κB p65陽性細胞數2.0±0.7 14.4±3.4①3.6±1.1③10.0±2.4 6.5±2.5②4.8±2.2②

炎癥反應是機體對損傷因子所產生的一種特異性防御反應，在損傷組織和血液中伴隨著復雜的多種炎癥介質以及炎癥相關通路蛋白表達水平的波動[9]。在眾多促炎性因子中，白介素-1β和腫瘤壞死因子-α是其中的關鍵因子[10]。TNF-α是由巨噬細胞、單核細胞經致炎因子刺激后所釋放的一種細胞因子，是一種促炎癥蛋白；IL-1β是一種炎性活細胞素，具有廣泛的生物學效應，可刺激各種免疫細胞和炎癥細胞，促進炎癥蛋白和炎癥介質的釋放，對中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞有趨化作用，增強炎癥反應。環(huán)氧合酶（COX）是前列腺素（PGs）合成過程中的關鍵酶，包括COX-1/COX-2 2種存在形式，其中COX-2為誘導型，是經刺激迅速產生的誘導酶，由各種損傷性化學、物理和生物因子均可誘導產生[11]，進而催化PGs合成，參與并持續(xù)影響炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展。

NF-κB信號通路是一條與炎癥反應關系密切的信號通路。正常生理條件下，NF-κB與它的抑制蛋白（IκB）相結合在胞漿內以無活性形式存在，當外界環(huán)境發(fā)生變化時，Akt作為其重要的上游分子，可通過磷酸化IκB激酶促使后者降解IκB，使NF-κB與IκB分離并活化最終轉移至細胞核調節(jié)轉錄，進而調節(jié)多種分子如炎癥介質、趨化因子、酶類等的表達，調節(jié)著炎癥反應的進程[10]。抑制NF-κB信號通路，可抑制促炎細胞因子（如TNF-α、IL-1β）、黏附因子、趨化因子、凝血因子等的過度合成與釋放，并且抑制與炎癥有關的基因表達，保護機體免受過度炎癥的傷害，因此，NF-κB被認為是多種炎癥因子轉錄調控的中心環(huán)節(jié)。

本課題組前期研究已通過體外抗真菌藥敏試驗證實了KBN觸變凝膠劑在大于13.03 mg/mL生藥濃度時對白色念珠菌具有較佳的抑制作用，透射電鏡結果表明其可能是通過破壞白色念珠菌的細胞壁、細胞膜的結構而達到抗真菌作用?；诖?，本研究從抗炎的角度進一步展開對KBN觸變凝膠劑的藥效研究。角叉菜膠致大鼠足跖腫脹模型和二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型是目前運用較多且成熟的2種抗炎性藥理模型，常用于篩選和評價藥物的抗炎作用，尤其是在我國傳統(tǒng)藥物的抗炎作用研究中起到了重要的作用[12]。本研究成功復制了角叉菜膠致大鼠足跖腫脹模型和二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型，通過與模型組比較，KBN觸變凝膠劑組足腫脹度與耳腫脹度顯著降低，具有確切的抗炎藥效。本研究進一步通過檢測NF-κB信號通路中關鍵蛋白與相關炎癥因子的表達水平探討其作用機制。結果顯示，與模型組比較，KBN觸變凝膠劑干預后大鼠血清中TNF-α、IL-1β的表達水平均呈劑量依賴性下降，提示KBN觸變凝膠劑的抗炎作用與抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β釋放有著密切關系。結果還表明KBN觸變凝膠劑能明顯抑制炎癥模型動物NF-κB p65、COX-2的表達，上調IκBα表達，推測抑制NF-κB通路活化及COX-2表達，進而減輕局部組織炎癥反應，此極有可能是KBN觸變凝膠劑發(fā)揮抗炎作用的主要機制之一。

綜上所述，KBN觸變凝膠劑具有良好的抗炎作用，其機制可能與抑制NF-κB信號通路活化進而降低炎癥因子的釋放有關。