淫羊藿苷對兔骨質(zhì)疏松的療效及骨組織MEG3、H19和DANCR表達(dá)的影響

張 峰,徐 瑞

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院創(chuàng)傷外科,濟(jì)寧 272100;*通訊作者,E-mail:zhangjiale99@tom.com)

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后翻譯以及表觀遺傳學(xué)水平來參與疾病的發(fā)生和發(fā)展[1,2]。MEG3作為一種長鏈非編碼RNA,在調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化過程中起重要作用,與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的異常分化密切相關(guān)[2,3],長鏈非編碼RNA H19和DANCR可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和分化[4,5]。體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)這三種長鏈非編碼RNA對成骨細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用,但是其與絕經(jīng)期后形成的骨質(zhì)疏松的關(guān)系尚無研究。淫羊藿苷是一種從天然植物中提取的黃酮類藥物,已被證明有促進(jìn)成骨與抑制破骨的雙重作用,但其具體如何影響骨質(zhì)疏松尚無明確結(jié)論。因此,本文研究淫羊藿苷對兔骨質(zhì)疏松的療效及骨組織中MEG3、H19和DANCR表達(dá)的影響,旨在為臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

淫羊藿苷購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(生產(chǎn)批號:20180901);1072型micro-CT購于比利時SkyScan公司,qRT-PCR檢測試劑盒購于美國Invitrogen公司;鼠抗兔BMP-2多克隆抗體購于英國Abcam公司;兔抗人GAPDH多克隆抗體購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 構(gòu)建兔骨質(zhì)疏松模型及藥物干預(yù)

48只3月齡雌性新西蘭白兔,(1.6±0.29)kg,按隨機(jī)數(shù)字法分成實(shí)驗(yàn)組、模型組和假手術(shù)組,每組16只。2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,假手術(shù)組實(shí)施假手術(shù)切除卵巢周圍脂肪一塊,模型組與實(shí)驗(yàn)組行雙側(cè)卵巢切除術(shù),切口長約3-4 cm,結(jié)扎卵巢血管,切除雙側(cè)卵巢及附著韌帶,可吸收線按順序縫合肌肉層、筋膜和皮膚。術(shù)后需每日觀察動物的切口愈合情況。術(shù)后1周對實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行淫羊藿苷灌胃給藥,每天劑量為20 mg/kg,假手術(shù)組與模型組每天灌胃生理鹽水20 mg/kg,治療時間8周。

1.3 標(biāo)本取材與處理

藥物干預(yù)8周,2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉,采用快速心臟急性大失血法處死兔,逐層剝離腰椎、雙側(cè)股骨及顱骨,剔除周圍軟組織,以無菌生理鹽水濕紗布包裹。70%乙醇固定股骨24 h行micro-CT掃描;取部分骨組織置于液氮中凍存?zhèn)溆?以行qRT-PCR檢測;另留取椎體、股骨、顱骨10%甲醛溶液固定,10%EDTA 6周,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,制成石蠟切片,60 ℃烤箱4 h,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Micro-CT觀察骨質(zhì)疏松顯微結(jié)構(gòu)和檢測骨參數(shù)指標(biāo)

取出固定股骨組織進(jìn)行micro-CT掃描,電壓100 kV,電流為98 mA,掃描過程中需將樣本密封在塑料包里以避免在掃描過程中出現(xiàn)移動或樣品脫水,獲取圖像。對圖像進(jìn)行閾值分割以從背景圖像中分割出骨的圖像,通過配套的3D軟件將2D圖像通過3D渲染獲得3D模型,微CT圖像分辨率為18.2 μm,根據(jù)三維圖像對股骨標(biāo)本的骨參數(shù)進(jìn)行分析。

1.5 qRT-PCR檢測骨組織mRNA表達(dá)水平

取出各組骨組織,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,Trizol提取組織的總RNA,并用特異性的LncRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴(kuò)增使用實(shí)時定量PCR預(yù)混合溶液SYBR Green qPCR Master Mix,參照qRT-PCR擴(kuò)增引物序列,實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法計算,以GAPDH作為內(nèi)源參照基因(見表1)。

表1 qRT-PCR擴(kuò)增引物序列

Table 1 qRT-PCR amplification primer sequence

基因 引物序列(5′-3′)MEG3前向:CTGCCCATCTACACCTCACG反向:CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGLnc-H19前向:GCACTGTATGCCCTAACCG反向:ATCCCTCCCTCCAACCCATDANCR前向:GCGCCACTATGTAGCGGGTT反向:TCAATGGCTTGTGCCTGTAGRunx2前向:ATGATGACACTGCCACCTCT反向:GGGATGAAATGCTTGGGAACGAPDH前向:TCACGGCAAATTCAACGGCACAGTCAAG反向:CAGCACCAGTGGATGCAGGGATGATGTT

1.6 免疫組化檢測骨組織BMP-2蛋白表達(dá)

取出石蠟切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,流水反復(fù)沖洗,甲醇過氧化氫孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性,Tris緩沖液沖洗3次,每次10 min,4 ℃下鼠抗兔BMP-2多克隆抗體(1 ∶100)孵育過夜。Tris緩沖液沖洗3次,每次10 min,兔抗人GAPDH多克隆抗體(1 ∶200)室溫孵育2 h,二氨基聯(lián)苯胺DAB顯色,光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖片,采用Image-Pro-Plus圖像分析軟件分析,用平均積分光密度值(Integral Optical density,IOD)表示。依據(jù)染色分?jǐn)?shù)評分和陽性細(xì)胞率評分評定結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松顯微結(jié)構(gòu)和骨參數(shù)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)組和模型組BV/TV、Tb·Th和Tb·N較假手術(shù)組均顯著下降(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組BV/TV、Tb·Th和Tb·N較模型組均明顯上升(P<0.05);實(shí)驗(yàn)組和模型組BS/BV和Tb·Sp較假手術(shù)組均顯著上升(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組BS/BV和Tb·Sp較模型組均顯著下降(P<0.05,見圖1、表2)。

圖1 股骨3D圖像Figure 1 The 3D image of femur

組別nBV/TV(%)BS/BV(%)Tb·Sp(mm)Tb·Th(mm)Tb·N(1/mm)假手術(shù)組161.03±0.125.84±0.470.05±0.020.49±0.072.45±0.44模型組 160.43±0.13?16.25±1.37?0.41±0.05?0.23±0.08?0.95±0.24?實(shí)驗(yàn)組 160.61±0.11?#11.25±1.89?#0.26±0.03?#0.31±0.06?#1.34±0.04?#

與假手術(shù)組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05

2.2 骨組織mRNA表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)組、模型組股骨和椎骨MEG3、Lnc-H19、DANCR和Runx2的mRNA水平較假手術(shù)組均明顯下降(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組股骨和椎骨MEG3、Lnc-H19、DANCR和Runx2的mRNA水平較模型組均明顯上調(diào)(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組和模型組顱骨DANCR、Lnc-H19和Runx2的mRNA水平較假手術(shù)組均明顯下調(diào)(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組DANCR和Runx2的mRNA水平高于模型組(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組Lnc-H19 mRNA水平低于模型組(P<0.05);三組MEG3水平無明顯差異(P>0.05,見表2)。

2.3 骨組織BMP-2蛋白表達(dá)

BMP-2表達(dá)定位于股骨成骨細(xì)胞胞質(zhì),陽性反應(yīng)呈黃色或棕黃色(見圖2)。依據(jù)免疫反應(yīng)評分得出假手術(shù)組、模型組、實(shí)驗(yàn)組BMP-2表達(dá)分別為5.81±0.43,3.40±0.35,4.51±0.32。模型組和實(shí)驗(yàn)組BMP-2蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組BMP-2蛋白表達(dá)較模型組增高(P<0.05)。

分組n指標(biāo)假手術(shù)組 模型組 實(shí)驗(yàn)組 股骨16MEG31.05±0.090.63±0.08?0.87±0.11?#Lnc-H191.31±0.070.49±0.04?0.71±0.06?#DANCR1.14±0.080.59±0.05?0.88±0.09?#Runx21.58±0.080.91±0.16?1.21±0.14?#椎骨16MEG30.49±0.050.25±0.07?0.41±0.4?#Lnc-H190.99±0.110.87±0.09?0.93±0.12?#DANCR0.97±0.050.63±0.12?0.84±0.10?#Runx20.86±0.140.47±0.13?0.61±0.12?#顱骨16MEG30.29±0.090.31±0.080.27±0.11Lnc-H190.58±0.080.51±0.07?0.46±0.06?#DANCR0.35±0.050.16±0.02?0.21±0.03?#Runx20.63±0.090.34±0.04?0.44±0.09?#

與假手術(shù)組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05

3 討論

淫羊藿苷是淫羊藿中含量最豐富的一種黃酮類成分,具有良好的骨再生和修復(fù)作用,越來越多的證據(jù)表明,淫羊藿苷既可以刺激骨形成,又可以抑制骨吸收,在骨轉(zhuǎn)化的動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用[6,7]。淫羊藿苷的藥物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,可以加載在生物材料上,從而形成局部的骨誘導(dǎo)[8,9]。因此,天然植物中提取的的淫羊藿苷成為了防治骨質(zhì)疏松癥的一種潛在藥物。LncRNA是一種長度≥200個核糖核酸的非編碼RNA,最新的研究表明,它在多種生物學(xué)過程中起著重要作用,如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞生長和腫瘤發(fā)生等[10]。既往的研究大多關(guān)注于骨質(zhì)疏松治療藥物對mRNA的影響,但是尚無藥物對lncRNA影響的研究,所以本研究主要探討在用淫羊藿苷對骨質(zhì)疏松治療的過程中相關(guān)lncRNA的變化情況。

圖2 免疫組化檢測股各組骨BMP-2蛋白表達(dá) (×200)Figure 2 Immunohistochemical detection of bone BMP-2 protein expression in each group (×200)

研究表明,在絕經(jīng)期后,MEG3在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)和miR-133a-3p的表達(dá)呈正相關(guān),并且MEG3可以通過靶向調(diào)控miR-133a-3p的表達(dá)從而抑制成骨分化[11-13]。長鏈非編碼RNA H19僅從母系遺傳,不編碼蛋白質(zhì)。在進(jìn)化過程中其高度保守,并且外顯子的突變率很低,這些特征就決定了其生物學(xué)功能的重要性。研究證實(shí),H19是成骨細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一[4,14],其可能與骨相關(guān)疾病有關(guān)。此外,研究發(fā)現(xiàn)DANCR可通過誘導(dǎo)IL-6和TNF-α的表達(dá)促進(jìn)骨的吸收,其可作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的生物標(biāo)志物[5]。DANCR還可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化,是成骨細(xì)胞分化的重要介質(zhì)[15]。

因而本文探究淫羊藿苷治療兔骨質(zhì)疏松對這三種非編碼RNA在股骨、腰椎(L5)和顱骨中的表達(dá)影響。本文研究結(jié)果顯示,治療后,股骨中H19表達(dá)上調(diào),與Li等[16]研究結(jié)果一致。淫羊藿苷干預(yù)后,兔骨質(zhì)疏松模型中RUNX2表達(dá)升高。Bustamante等[17]在821名西班牙絕經(jīng)期婦女的研究中發(fā)現(xiàn),RUNX2與腰椎和股骨頸的骨密度有關(guān)。進(jìn)一步比較免疫組化,結(jié)果顯示淫羊藿苷治療后BMP2在股骨頸中的表達(dá)明顯上升,進(jìn)一步證實(shí)淫羊藿苷對兔骨質(zhì)疏松的良好臨床療效。

外源性淫羊藿苷對骨質(zhì)疏松的作用表現(xiàn)在脛骨的骨小梁增加。且淫羊藿苷對長鏈非編碼RNA(MEG3、H19、DANCR)的影響主要表現(xiàn)在股骨,對椎骨、顱骨的影響分別表現(xiàn)在MEG3和DANCR。

綜上,淫羊藿苷可通過促進(jìn)股骨MEG3、H19和DANCR的表達(dá)來促進(jìn)骨質(zhì)疏松的治療。