轉(zhuǎn)色期乙醇與氯化鈣處理對‘克瑞森無核'葡萄成熟特性及品質(zhì)的影響

石美 賈旭 張航航 彭小慧 于建娜*

（1南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)（2塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

‘克瑞森無核'葡萄又名淑女紅、克里森、緋紅無核，屬亞歐葡萄，晚熟品種。1998年由美國加州戴維斯農(nóng)學(xué)院引入中國，一般在9月下旬至10月初成熟?！巳鹕瓱o核'葡萄果實呈橢圓形，果皮顏色鮮亮，果肉多汁味美，具有坐果率高，抗病性強，耐儲藏等優(yōu)點［1]。無核葡萄在釀造葡萄酒、葡萄汁以及其他食品生產(chǎn)方面具有多方面用途。近年來，隨著葡萄產(chǎn)業(yè)重心的西移，‘克瑞森無核'葡萄在新疆種植面積迅速增加。新疆阿克蘇地區(qū)地屬塔里木盆地，夏季酷暑干燥，晝夜溫差大，年均降水量50～70 mm，白天光照充足，提供了葡萄最適宜的生長環(huán)境。由于地處偏遠，加之栽培技術(shù)落后，限制了‘克瑞森無核'葡萄果實品質(zhì)及產(chǎn)量，主要表現(xiàn)在果粒小，著色不佳等。加之葡萄采收期較集中，貨架期短，儲藏成本高，嚴重降低了‘克瑞森無核'葡萄在新疆的市場經(jīng)濟效益。

乙醇是植物天然次生代謝產(chǎn)物，在有氧情況下，果蔬體內(nèi)含低濃度的乙醇，但在缺氧條件下乙醇能夠被大量合成［1]。近幾年，一些研究人員使用乙醇蒸氣或浸漬處理果蔬，在采后延緩組織衰老、抑制果蔬腐爛和有效控制果實褐變方面已做了大量研究，其中包括櫻桃［3]，葡萄［4]，茄子［5]，青筍［6]，蘋果［7]，楊梅［8]和豌豆［9]等。不僅如此，采前乙醇噴施處理還可有效干預(yù)果實成熟［10]、提高抗氧化能力［11]、改善果實著色［12]等作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的乙醇對水果和蔬菜損害很?。?]，而乙醇對果蔬成熟的促進或抑制作用和乙醇濃度高低有關(guān)［13]。Kereamy A E［14]等人研究發(fā)現(xiàn)，5%乙醇采前噴施‘赤霞珠'葡萄，發(fā)現(xiàn)乙醇啟動了UFGT基因的表達提高了花色苷的含量。鈣對植物生長發(fā)育參與了必要的營養(yǎng)支持，且有研究發(fā)現(xiàn)，硼+鈣在番茄幼苗時期噴施處理，在收獲時與對照比顯著抑制了呼吸作用，增加了細胞壁緊密度，降低乙烯的合成，保持了番茄果實的硬度并延緩了果實成熟［15]。

葡萄果實的成熟時間及采收期直接影響果實的商品價值。乙醇等非激素小分子代謝產(chǎn)物能夠影響植物的代謝通路，但相關(guān)研究較少。為此，本文通過轉(zhuǎn)色期乙醇處理‘克瑞森無核'葡萄，分析葡萄果實轉(zhuǎn)色期至成熟期間各項指標動態(tài)的變化，明確采前乙醇處理對葡萄果實生理變化的影響，為進一步研究葡萄果實的成熟生理與分子調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在新疆阿拉爾市十二團四連一個普通葡萄園內(nèi)進行。選取長勢基本一致、樹勢健壯且無病蟲害的3年生‘克瑞森無核'葡萄為試材。按常規(guī)栽培模式進行栽培管理，葡萄籬架式栽培，栽培株行距為0.5 m×6 m，每株留果穗數(shù)為30～40串，整形修剪與肥水管理等其它栽培同常規(guī)管理。

1.2 儀器與設(shè)備

精密電子天平（BS323S，北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），紫外分光光度計（TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），質(zhì)構(gòu)儀（TMS-PRO，F(xiàn)ood Technology Corporation）；色差儀（MinoltaCR-400，日本），糖酸一體機（PAL-BX|ACID，日本），-80℃超低溫冰箱（MDF-U54V上海松下健康醫(yī)療器械有限公司）

1.3 試驗處理

試驗共設(shè) 4個處理：分別是TC1：1%氯化鈣（CaCl2）、TC2：15% 乙醇（EtOH）中溶入 1% 氯化鈣（CaCl2）、TC3：15%乙醇（EtOH）、CCK（對照）：清水噴施。

在葡萄果實轉(zhuǎn)色期（2017年8月7日）進行乙醇噴施處理。每個處理噴施5株葡萄，重復(fù)噴施3次。在果實生長區(qū)用手持噴霧器進行噴施。處理后從2017年8月8日開始定期取樣，直至葡萄成熟結(jié)束（9月26日），每7天采一次樣，共采樣8次。采樣時從各處理葡萄株的上、中、下三個部位的5～6個的果穗上采摘大小均勻的60粒果實，立即帶回實驗室隨即選取30粒果實進行相關(guān)生理指標測定，其余30粒果實于保鮮袋中放置在-80℃冰箱冷凍儲藏。

1.4 測定方法

1.4.1 單果重、果?？v橫經(jīng)、可溶性固形物含量（TSS）、可滴定酸含量（TA）的測定

定期取樣后，立即將60粒果實樣品帶回實驗室進行單果重、果實縱橫經(jīng)、可溶性固形物含量（TSS）、可滴定酸（TA）含量的測定。每個處理隨機選取30粒果實測定平均單果重量，同時用游標卡尺測定各處理果實平均縱橫徑。用手動榨汁機擠出果實汁液混合后用糖酸一體機測定可溶性固形物含量和可滴定酸含量。

1.4.2 葡萄果皮總酚含量

參照趙雪［16]等方法，將7 g葡萄果皮浸入到20 mL甲醇中，在室溫條件下提取24 h，溶液輕輕移入干凈容器。殘渣用20 mL的甲醇溶液提?。╩ethanol/water 80/20，v/v）4 h，溶液輕輕移入干凈容器，殘渣繼續(xù)用20 mL的甲醇溶液提?。╩ethanol/water 50/50，v/v）4 h，溶液再次輕輕移入其他容器。最后將所有提取液混合。

待測葡萄皮、肉樣品分別取100 μL加入10 mL的試管中7 mL蒸餾水，搖勻，再加0.5 mL福林試劑，充分搖勻，1 min后，加入20%碳酸鈉溶液1.5 mL，混勻，最后加入0.9 mL蒸餾水。避光反應(yīng)60 min后，于765 nm波長下比色，測定吸光度，每個處理重復(fù)3次。結(jié)果以沒食子酸等價值表示，沒食子酸標準溶液濃度為：0、50、100、150、250 和 500 mg/L。

1.4.3 果實硬度

果實硬度使用質(zhì)構(gòu)儀測定，采用最大量程為25 N的圓柱形探頭進行TPA測試。測試參數(shù)：形變百分數(shù)為25%，兩次壓縮停頓時間為5 S，起始力為0.05 N，檢測速度為60 mm/min。

1.4.4 果皮色澤、葉綠素含量及花青素含量

果實表面色澤使用色差儀測定，色澤度值被表示為CIEL*a*b*系統(tǒng)，L*值表示顏色的亮度。a*正值表示紅色程度，a*負值表示綠色程度；b*正值表示黃色程度，b*負值表示藍色程度，并通過公式hab=tan-1（b*/a*）換算為h°，每7 d測定1次。每處理用果10個，每個果實在赤道部位相對應(yīng)的兩個面測定2次。

花色苷和葉綠素含量測定方法均參照李燦嬰［17]等人?；ㄉ蘸康臏y定：稱取果皮1 g，立即以1%的HCl-甲醇溶液定容于15 mL容量瓶，在黑暗條件下提取24 h（以果皮變白為準），然后用UV-1800型紫外分光光度計，分別于600 nm、530 nm（花青苷）測定吸收變化，以U1=（OD530-OD600）/g FW=0.1作為一個花青苷單位。

葉綠素含量的測定，取1 g果皮加入10 mL 80%丙酮在黑暗條件下提取24 h（以果皮變白為準），然后用UV-1800型紫外分光光度計分別于645 nm、663 nm下測吸光度，根據(jù)吸光度值計算出葉綠素總量，單位為mg/g。

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2016和SPSS 21.0軟件進行處理，用Origin軟件作圖；利用Duncan新復(fù)極差法進行差異顯著性分析，每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)色期乙醇與氯化鈣處理對‘克瑞森無核’葡萄果實成熟期間品質(zhì)相關(guān)指標的影響

2.1.1 對葡萄單果重、果實縱橫徑、可溶性固形物（TSS）、可滴定酸（TA）含量的影響

由圖1可以看出，單果重隨葡萄果實成熟不斷增加。在盛花后78 d至106 d單果重呈逐漸上升趨勢，盛花后113 d至126 d期間果重已趨于穩(wěn)定。TC1、TC2處理的單果重在成熟期間始終高于對照組，且與對照差異顯著（P＜0.05）。采收時，TC2處理果重值為5.22 g，對照為4.67 g。結(jié)果表明，15%乙醇（EtOH）中溶入1%氯化鈣（CaCl2）顯著提高了單果重，促進了果實發(fā)育。

圖1 采前乙醇和氯化鈣處理對葡萄果實成熟期間單果重的影響

隨著葡萄果實不斷生長發(fā)育，各處理縱、橫徑不斷增加。由圖2可以看到，TC2處理相比對照增加了果實的縱徑和橫徑，增大了果粒大小。采收時，TC2處理與對照比達到顯著水平（P＜0.05）。結(jié)果表明，15%乙醇（EtOH）中溶入1%氯化鈣（CaCl2）增加了果粒的縱、橫徑，促進了果實的發(fā)育（圖2a、b）。

圖2 采前乙醇和氯化鈣處理對葡萄果實成熟期間果實縱徑（a）、橫徑(b)的影響

可溶性固形物含量（TSS）和可滴定酸含量(TA)是影響葡萄果實成熟度和風(fēng)味的重要組成物質(zhì)。由圖3可以看出，隨著‘克瑞森無核'葡萄果實成熟過程中果實內(nèi)TSS含量不斷增加，TA含量不斷下降。

從整個成熟過程來看（圖3a），各處理TSS含量與對照變化趨勢一致。采收時以TC1處理TSS含量最低為21.7%，對照為23.2%，顯著低于對照組（P＜0.05）。采收時，TC2處理TSS含量為22.7%，與對照無顯著）差異（P＞0.05）。由圖3（b）可以看到，轉(zhuǎn)色期至盛花后106 d期間，TC2處理的TA含量始終高于對照組。在成熟后期（盛花后113 d～120 d），對照TA含量略高于TC2處理。采收時，對照TA含量迅速下降到最低含量為0.86%，TC2處理TA含量為1.03%，與對照比差異顯著（P＜0.05）。測定結(jié)果表明，15%乙醇（EtOH）中溶入1%氯化鈣（CaCl2）處理可顯著抑制采收期TA含量的下降，對TSS含量無顯著影響。

圖3 采前乙醇和氯化鈣處理對葡萄發(fā)育過程中可溶性固形物含量(a)和可滴定酸含量(b)的影響

2.1.2對葡萄果皮總酚含量的影響

酚類物質(zhì)作為果實重要的次級代謝產(chǎn)物，具有較強的抗氧化活性，能夠清除人體自由基，有較好的抗衰老作用［18]。葡萄果實酚類物質(zhì)主要累積于果皮，果肉總酚含量極少。由圖4可以看出，各處理的總酚含量整體上是先下降后上升的趨勢。盛花后78 d至99 d期間，TC2、TC3總酚含量均顯著高于對照組。成熟后期（盛花后106 d至采收）各處理的總酚含量緩慢上升。對照組總酚含量迅速累積達到最大值為58.170 mg/100 g FW，均大于處理組。采收時，以TC2處理的總酚含量最低為52.533 mg/100 g FW，顯著（P＜0.05）低于對照組。實驗結(jié)果表明，TC2處理顯著抑制了采收期總酚含量的積累。

圖4 采前乙醇和氯化鈣處理對葡萄發(fā)育過程中總酚含量的影響

2.1.3 對果實硬度的影響

硬度是衡量果實成熟度的一項重要指標。隨著果實不斷成熟，硬度逐漸下降。由圖5可看出，在轉(zhuǎn)色期至采收TC2處理的硬度整體高于對照組，保持了果實的硬度。TC1處理在盛花后106 d至采收期間硬度始終高于對照組，且差異顯著（P＜0.05）。試驗結(jié)果表明，TC1、TC2與對照比保持了果實的硬度，延緩了果實的軟化。

圖5 采前乙醇和氯化鈣處理對葡萄發(fā)育過程中果實硬度的影響

2.2 轉(zhuǎn)色期乙醇與氯化鈣處理對‘克瑞森無核’葡萄果實成熟期間生理特性的影響

2.2.1 對果實色澤的影響

在色差表示中，L*值表示亮度，果皮亮度越高表明果面的光潔度越高，L*值隨著果實成熟而降低。由圖6（a）可以看到，隨著葡萄的成熟期延長，果實亮度逐漸下降。采收時，各處理L*值與對照比均無顯著差異。

Hue Angle（ho）值常用來表示果實的顏色，是果實成熟最直觀的表征。Hue Angle值為90時表示黃色，180時為綠色，0為紅色,值越大表示果實的顏色越綠。如圖6（b）所示，ho值緩慢下降，表明果實顏色逐漸轉(zhuǎn)紅。在盛花后92 d至106 d期間果實迅速轉(zhuǎn)紅，隨后果實顏色趨于穩(wěn)定。采收時TC1、TC2處理ho值低于對照組，但無顯著差異(P＞0.05)。測定結(jié)果表明，各處理對葡萄果實的色澤無明顯影響。

圖6 采前乙醇和氯化鈣處理對葡萄果實發(fā)育過程中果實色澤（L＊值(a)、ho值 (b)）的影響

2.2.2 對葉綠素含量和花色苷含量的影響

成熟葡萄果皮中存在大量的花色苷。花色苷和葉綠素含量在果實色澤改變中發(fā)揮重要作用［19]。從圖7(a)可以看到，葉綠素含量隨著果實成熟不斷降低。TC2處理在盛花后99 d至采收期間，葉綠素含量迅速降低，且低于對照及其他處理，隨后含量平穩(wěn)直至采收。采收時，TC2、TC3保持較高的葉綠素含量，含量分別為0.047 5 mg/g和0.046 2 mg/g，與對照（0.039 mg/g）差異顯著（P＜0.05）。測定結(jié)果表明，TC2處理顯著(P＜0.05)抑制了采收期葉綠素含量的下降。

如圖7(b)所示，隨著葡萄果實的成熟，花色苷含量不斷積累，各處理與對照變化趨勢一致。盛花后113 d至采收期間TC2處理始終高于對照組，采收時TC2處理花色苷含量為18.186 U/gFW，對照為20.663 U/gFW，達到顯著水平（P＜0.05）。測定結(jié)果表明，TC2處理可顯著（P＜0.05）抑制果實采收期花色苷含量的積累。

圖7 采前乙醇和氯化鈣處理對葡萄發(fā)育過程中果實葉綠素含量(a)花色苷含量(b)的影響

3 討論與結(jié)論

有研究表明，適當(dāng)濃度的外源乙醇處理可以促進或抑制果實的成熟和后熟，而乙醇對果實成熟的抑制或促進作用是受濃度影響，且隨果實初始成熟度的變化而變化［20]。本試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)色期乙醇和氯化鈣處理可抑制‘克瑞森無核'葡萄果實的成熟，這可能與15%乙醇處理濃度有關(guān)。葡萄果實的大小和果重決定了果實的商品價值，鈣對植物生長發(fā)育起關(guān)鍵性作用［21]。在本文的研究中，15%乙醇（EtOH）中溶入1%氯化鈣（CaCl2）處理提高了單果重，增加了果實的縱橫徑，顯著促進了果實發(fā)育，提高了葡萄果實產(chǎn)量，其原因可能是由于Ca2+刺激葡萄體內(nèi)細胞分裂素的分泌量增多有關(guān)。另有研究者發(fā)現(xiàn)，鈣離子可以通過與細胞壁內(nèi)的果膠聚合物交聯(lián)［22]和保護細胞膜完整性［23]。在本文中，1%氯化鈣（CaCl2）處理與對照比保持了較高的硬度，這可能是由于Ca2+使得葡萄細胞壁增厚，維持了果實的硬度，從而延緩了果實的軟化。

花色苷含量的積累與可溶性固形物含量變化有密切聯(lián)系。當(dāng)果實內(nèi)的糖含量達到一定的量時，花色苷開始積累，葉綠素含量下降，果實開始上色［24]。15%乙醇（EtOH）中溶入1%氯化鈣（CaCl2）顯著抑制采收期可滴定酸含量的下降，但對可溶性固形物含量無顯著影響，這可能與成熟期延長有關(guān)。同時，該處理顯著延緩了花色苷含量的增加和葉綠素含量降低，整體延緩了果實的成熟。Chervin C［25]等人發(fā)現(xiàn)，用2.5、5和10%乙醇處理會減少‘赤霞珠'葡萄果實花青素的含量，這與本試驗中花色苷含量積累受到抑制結(jié)果類似。果實色澤主要受葡萄內(nèi)色素含量的影響。本試驗中，15%乙醇（EtOH）中溶入1%氯化鈣（CaCl2）延緩了花色苷含量的積累及抑制葉綠素含量的下降，但對果實外觀色澤無不良影響。

大量研究證明，果實的生長發(fā)育及成熟受果實內(nèi)源激素調(diào)控［26]作用。高漫江［27]等人研究發(fā)現(xiàn)，葡萄果實成熟受內(nèi)源激素ABA、GA3、JA共同調(diào)控作用，以及影響相關(guān)基因的差異表達。Kou L［28]等人研究發(fā)現(xiàn)西蘭花采前噴施10 mMCaCI2，顯著影響了衰老基因BoSAG12、BoGPX6、BoCAT3和BoSAG12的表達，從而提高了果實采后品質(zhì)及貨架期。本文已證實適當(dāng)濃度的乙醇和氯化鈣處理可延長‘克瑞森無核'葡萄的成熟期，其是否影響了相關(guān)內(nèi)源激素的含量和相關(guān)基因的表達，還需進一步試驗研究。

本試驗研究結(jié)果表明，15%乙醇（EtOH）中溶入1%氯化鈣（CaCl2）處理抑制了總酚的積累和可滴定酸含量的下降；延緩了采收期葉綠素含量的降解和花色苷含量的積累，對果實色澤無明顯影響，總體延緩葡萄果實成熟進程；提高了單果重，增加了縱橫徑，促進了果實發(fā)育，提高了葡萄果實的品質(zhì)。