一對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)的多病原跟蹤*

武和英 王秀華 楊 冰 于黨輝 黃 倢

一對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)的多病原跟蹤*

武和英1,2王秀華2,3①楊 冰2,3于黨輝2黃 倢2,3

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

本研究通過(guò)對(duì)一對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)定期采樣，采用分子生物學(xué)鑒定方法，分別對(duì)對(duì)蝦體內(nèi)及水環(huán)境中弧菌(sp.)、蝦肝腸胞蟲(, EHP)及主要病毒性病原進(jìn)行了跟蹤檢測(cè)，同時(shí)，檢測(cè)了水環(huán)境中的氨氮及亞硝基氮含量的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示，該對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)中存在的主要病原為多種致病弧菌和EHP，未檢測(cè)出對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)、偷死野田村病毒(CMNV)及傳染性皮下和造血組織壞死病毒(IHHNV)；該養(yǎng)殖場(chǎng)中弧菌檢出種類達(dá)到16種，其中，主要的弧菌種類有副溶血弧菌()溶藻弧菌 ()歐文氏弧菌()創(chuàng)傷弧菌()哈維氏弧菌()，且存在導(dǎo)致急性肝胰腺壞死病的副溶血弧菌(VPAHPND)；養(yǎng)殖中期大棚養(yǎng)殖池水體氨氮及亞硝氮濃度分別達(dá)到(3.5±2.0)、(8.2±0.7) mg/L，顯著高于室外養(yǎng)殖池水體氨氮及亞硝基氮濃度(<0.05)。養(yǎng)殖期跟蹤的7個(gè)蝦池中，出現(xiàn)嚴(yán)重對(duì)蝦病害的大棚養(yǎng)殖池比例達(dá)到100%，而室外養(yǎng)殖池僅出現(xiàn)輕度對(duì)蝦病害，發(fā)病池比例為25%。根據(jù)研究結(jié)果推測(cè)，造成大棚養(yǎng)殖池對(duì)蝦發(fā)病死亡的主要原因?yàn)轲B(yǎng)殖對(duì)蝦感染弧菌及蝦肝腸胞蟲，同時(shí)，養(yǎng)殖密度大、水體氨氮及亞硝基氮濃度過(guò)高等在對(duì)蝦病害發(fā)生中起到了協(xié)同作用。本研究結(jié)果可為當(dāng)前對(duì)蝦養(yǎng)殖病害防控技術(shù)提供理論支持和科學(xué)依據(jù)。

凡納濱對(duì)蝦；病原；弧菌；蝦肝腸胞蟲；病毒?。徊≡?/p>

近年來(lái)，對(duì)蝦病害給國(guó)內(nèi)外對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，其特點(diǎn)表現(xiàn)為對(duì)蝦發(fā)病期提前(Tran, 2013)，病原種類繁多(韓琳等, 2018)，蝦病發(fā)生區(qū)域廣(Lightner, 2012; Nunan, 2014; Soto-Rodriguez, 2015; 王博雅等, 2017; 陳祿芝等, 2016)，且患病對(duì)蝦死亡率高(Han, 2015; Hernández-Palomares, 2018)。研究發(fā)現(xiàn)，目前中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖中主要存在的病毒性病原有白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV) (Hernández-Palomares, 2018)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)(Yan, 2016; 李秋璇等, 2015)、傳染性肌肉壞死病毒(Infectious myonecrosis virus，IMNV)(Kurcheti, 2017)及偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus, CMNV)(Zhang, 2017)，最新報(bào)道還存在對(duì)蝦黃頭病毒(Sinnuengnong, 2018; 朱羅羅等, 2016)、對(duì)蝦虹彩病毒(Qiu, 2017)；細(xì)菌性疾病主要為急性肝胰腺壞死綜合癥(Hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)(Han，2015；孫明玉等, 2018)和微孢子蟲病原蝦肝腸胞蟲(,EHP)導(dǎo)致的蝦肝腸胞蟲病(Prasertsri, 2009)。

在對(duì)蝦疾病防控方面，無(wú)論對(duì)蝦種苗場(chǎng)還是養(yǎng)殖場(chǎng)都已采取了防控措施，減少對(duì)蝦病原感染率、降低養(yǎng)殖水體中的病原數(shù)量，采用各種水質(zhì)改良劑、微生態(tài)制劑改善水質(zhì)，提高對(duì)蝦抗病力(Warneke, 2011; 王春迪等, 2016)，對(duì)蝦病害發(fā)生率依然沒(méi)有顯著下降(王筱珊等, 2017；陳祿芝等, 2016; 王博雅等, 2017; 施慧等, 2017)，且國(guó)內(nèi)對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量呈逐年下降趨勢(shì)。

為查明當(dāng)前對(duì)蝦養(yǎng)殖中病害形成的原因，本研究選擇山東濰坊沿海1個(gè)具備大棚養(yǎng)殖池、室外養(yǎng)殖池的凡納濱對(duì)蝦()養(yǎng)殖場(chǎng)作為蝦病調(diào)查研究的采樣點(diǎn)，采取定期取樣的方法，跟蹤監(jiān)測(cè)了對(duì)蝦及水體中的主要病原的種類數(shù)量，水中氨氮及亞硝基氮濃度的變化及對(duì)蝦病害發(fā)生情況，以期通過(guò)分析養(yǎng)殖場(chǎng)的對(duì)蝦疾病感染過(guò)程、發(fā)病特點(diǎn)，找出患病死亡的原因，為對(duì)蝦養(yǎng)殖的疾病防控提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖場(chǎng)基本資料收集

1.1.1 養(yǎng)殖場(chǎng)基本情況 對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)位于山東省濰坊市北部近海的內(nèi)陸鹽堿地區(qū)域，養(yǎng)殖用水為近海河口區(qū)水源。養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)有水面13.8 hm2，其中，養(yǎng)殖用室外池塘30個(gè)(小型池塘12個(gè)，每個(gè)面積為0.2 hm2；中型池塘18個(gè)，每個(gè)面積為0.3 hm2)；大棚養(yǎng)蝦池4個(gè)(小型棚2個(gè)，每個(gè)0.1 hm2；大型棚 2個(gè)，每個(gè)0.5 hm2)。另有大型池塘6個(gè)，每個(gè)面積為0.8 hm2，用于水處理。室外養(yǎng)殖池平均有效水深為1.6 m，大棚養(yǎng)殖池平均有效水深為1.4 m。從其中隨機(jī)抽取池塘7個(gè)為跟蹤取樣蝦池，池塘編號(hào)、面積、放苗時(shí)間及密度等信息見(jiàn)表1。

表1 養(yǎng)殖池的基本情況

Tab.1 Basic information of the shrimp ponds

注：C1~C4：育苗場(chǎng)；G1~G3：大棚養(yǎng)殖池；W1~W4：室外養(yǎng)殖池

Note: C1~C4: Shrimp hatcheries; G1~G3: Indoor ponds; W1~W4: Outdoor ponds

1.1.2 養(yǎng)殖管理 養(yǎng)殖用水先經(jīng)漂白粉(30 mg/L)處理，再曝氣脫氯后使用，養(yǎng)殖期間，水體鹽度為11±3.6，pH為7.8~8.5，大棚養(yǎng)殖池水溫為26.2℃~ 32.5℃，室外養(yǎng)殖池水溫為23℃~28.5℃。大棚養(yǎng)殖池配備底部增氧管(3 W/m2)及水車式增氧機(jī)(1.5 W/m2)，室外養(yǎng)殖池配備水車式增氧機(jī)(1.5 W/m2)。在養(yǎng)殖期間，室外養(yǎng)殖池水體中的DO>5 mg/L，大棚養(yǎng)殖池水體DO>4 mg/L。養(yǎng)殖投喂人工配合餌料，蝦苗體長(zhǎng)為3 cm以前，日投喂 6次，日投餌量為對(duì)蝦體重的5%；3 cm后，日投喂4次，日投餌量為對(duì)蝦體重的3%。大棚養(yǎng)殖池日換水量為(20±5)%，外塘養(yǎng)殖池每10 d換水1次，每次20%。

1.1.3 數(shù)據(jù)采集 自放苗開(kāi)始，每20 d跟蹤檢測(cè)蝦池及進(jìn)水渠的水質(zhì)指標(biāo)(溫度、鹽度、pH、DO、氨氮、亞硝氮)的變化情況，采集水樣、對(duì)蝦樣品進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、病原檢測(cè)，并觀察記錄對(duì)蝦發(fā)病癥狀。

1.2 樣品采集及處理

1.2.1 水樣采集 用無(wú)菌瓶于換水前，在每個(gè)采樣池中取水樣100 ml，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，用于氨氮及亞硝基氮分析。

1.2.2 細(xì)菌分離 從養(yǎng)殖場(chǎng)水源和養(yǎng)殖池水體中分別取100 μl的水樣，滅菌海水10倍梯度稀釋，無(wú)菌狀態(tài)下涂布2216E和TCBS固體培養(yǎng)基；無(wú)菌取對(duì)蝦腸道及肝胰腺混合研磨后，用生理鹽水10倍梯度稀釋，分別涂布2216E和TCBS的固體培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 病原檢測(cè)樣品采集 每個(gè)池塘每次取對(duì)蝦30尾，鰓絲、步足、肌肉及肝胰腺樣品合并為 1個(gè)獨(dú)立樣品，放入95%的乙醇中保存帶回實(shí)驗(yàn)室，用TIANGEN試劑盒(TIANamp Marine Animals DNA Kit)提取樣品全基因組DNA，-80℃保存?zhèn)溆?；用RNAiso Plus (TaKaRa)提取樣品總RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 可培養(yǎng)細(xì)菌分析及弧菌的占有率

1.3.1 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離鑒定 取接種培養(yǎng)后的2216E平板，根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)、大小、顏色等進(jìn)行分離純化。用細(xì)菌16S rDNA序列擴(kuò)增方法對(duì)所分離的細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定(Bikrol,2010)，擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司分析，所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.3.2 水體中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)及總弧菌數(shù)評(píng)估 根據(jù)某水樣在一定稀釋度下涂布2216E平板形成的菌落數(shù)，推算該原始水樣每毫升中的總細(xì)菌數(shù)為單位水體中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)；根據(jù)某水樣在一定稀釋度下涂布TCBS平板形成的菌落數(shù)，推算該原始水樣總弧菌數(shù)量，單位為CFU/ml。

1.3.3 某種弧菌占有率 根據(jù)TCBS平板所分離弧菌的菌落數(shù)、鑒定結(jié)果及樣品稀釋度，分別統(tǒng)計(jì)大棚養(yǎng)殖池和室外養(yǎng)殖池中各種弧菌(sp.)的數(shù)量?；【加新?單位水體中某種弧菌數(shù)量/單位水體中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)×100%。

1.4 對(duì)蝦多病原檢測(cè)

EHP及AHPND的檢測(cè)方法分別參照J(rèn)aroenlak等(2016)和Dangtip等(2015)的方法；WSSV、IHHNV及IMNV的檢測(cè)采用國(guó)際獸疫局(Office Interna- tional des Epizooties, OIE 2016)推薦的檢測(cè)方法，CMNV檢測(cè)參照Z(yǔ)hang等(2014)的方法。其中，WSSV、IMNV及CMNV均為套式PCR，IHHNV采用常規(guī)PCR 2對(duì)物檢測(cè)。

1.5 水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)

使用YSI556便攜式水質(zhì)測(cè)定儀(Xylem, 美國(guó))，每個(gè)取樣日的09:00測(cè)量養(yǎng)殖池水體溫度、鹽度、溶解氧和pH。水體中氨氮和亞硝基氮的濃度測(cè)定分別采用靛酚藍(lán)分光光度法(GB17378.4-2007)和萘乙二胺分光光度法(GB17378.4-2007)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD,=3)表示，運(yùn)用SPSS 18.0軟件，經(jīng)單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan’s多重檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性，設(shè)置差異水平=0.05 (<0.05為差異顯著)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)蝦生長(zhǎng)及病害發(fā)生情況

觀察各采樣池塘中的對(duì)蝦發(fā)病情況，記錄發(fā)病時(shí)間，各蝦池病癥初次發(fā)生時(shí)間見(jiàn)表2。該養(yǎng)殖場(chǎng)大棚蝦池在發(fā)病前10 d已表現(xiàn)出攝食減少、生長(zhǎng)緩慢的癥狀，之后陸續(xù)出現(xiàn)對(duì)蝦不攝食、空腸空胃、腸道細(xì)、趴邊，末期對(duì)蝦腹部和尾節(jié)變白，1周后出現(xiàn)死亡，且死亡率升高，最后出池；G2對(duì)蝦癥狀與死亡情況與G1完全相似，相應(yīng)的癥狀出現(xiàn)的時(shí)間僅較G1池晚4 d左右；G3的對(duì)蝦發(fā)病較為迅速，癥狀表現(xiàn)為對(duì)蝦不攝食，空腸空胃，發(fā)病1周后，對(duì)蝦死亡率近50%，消毒排塘。根據(jù)對(duì)蝦的發(fā)病特點(diǎn)及檢測(cè)結(jié)果，初步判定大棚養(yǎng)殖池中的對(duì)蝦發(fā)病為弧菌與蝦肝腸胞蟲混合感染所致，且與水體中氨氮、亞硝氮濃度過(guò)高有關(guān)；室外養(yǎng)殖池整個(gè)養(yǎng)殖周期發(fā)病較輕，個(gè)別池塘在養(yǎng)殖后期出現(xiàn)一定的發(fā)病癥狀，表現(xiàn)為對(duì)蝦趴邊，空腸空胃，但數(shù)量較少，跟蹤的4個(gè)室外養(yǎng)殖池中，僅W1在9月25日出現(xiàn)病癥，死亡率極低，因?yàn)橐训绞斋@季節(jié)，采取了收蝦處理。

表2 各池對(duì)蝦發(fā)病情況

Tab.2 Occurrence of shrimp disease in different ponds

注：□/※：對(duì)蝦發(fā)病出現(xiàn)死亡，檢測(cè)確認(rèn)感染弧菌及腸胞蟲；–：對(duì)蝦正常；+?：對(duì)蝦發(fā)病但沒(méi)有檢測(cè)

Note: □/※: Shrimp infected by AHPND and EHP in the same time and appeared death; –: Shrimp is normal; +?: Dead shrimp appeared but without detection

2.2 整個(gè)檢測(cè)期養(yǎng)殖水體及對(duì)蝦體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌組成

整個(gè)檢測(cè)期間，共分離單菌落305個(gè)，對(duì)所分離的細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定，共成功鑒定細(xì)菌258株，其中，養(yǎng)殖水體中164株，對(duì)蝦體內(nèi)94株。比對(duì)結(jié)果顯示，養(yǎng)殖水體中164株菌中含有菌株49種，對(duì)蝦體內(nèi)有菌株31種，對(duì)蝦體內(nèi)和水體主要細(xì)菌組成見(jiàn)表3。由表3可知，養(yǎng)殖水體中菌群種類比對(duì)蝦體內(nèi)的種類多。

表3 對(duì)蝦體內(nèi)和養(yǎng)殖水體中的菌群組成

Tab.3 Component of predominant bacterial communities isolated from shrimp and water

續(xù)表3

2.3 不同養(yǎng)殖期大棚養(yǎng)殖池與室外養(yǎng)殖池中總弧菌密度

分別統(tǒng)計(jì)不同采樣時(shí)間所有跟蹤的大棚及室外養(yǎng)殖池中弧菌平均數(shù)量(圖1)。由圖1可知，經(jīng)過(guò)漂白粉處理后，再經(jīng)過(guò)脫氯曝氣的水，進(jìn)入養(yǎng)殖池后其內(nèi)的弧菌數(shù)量在10 CFU/ml左右，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增長(zhǎng)，無(wú)論室外養(yǎng)殖池還是大棚養(yǎng)殖池，水體中的弧菌數(shù)量都持續(xù)增多。且在各個(gè)采樣時(shí)間內(nèi)大棚養(yǎng)殖池中的弧菌數(shù)量均高于室外養(yǎng)殖池，至最后一次采樣(8月13日)，大棚養(yǎng)殖池中弧菌的平均密度達(dá)到了(3.7±0.9)′104CFU/ml；而室外養(yǎng)殖池僅為(6.3±4.0)′102CFU/ml。

圖1 大棚養(yǎng)殖池及室外養(yǎng)殖池中弧菌數(shù)量的變化趨勢(shì)

2.4 室外養(yǎng)殖池與大棚養(yǎng)殖池中不同采樣時(shí)間內(nèi)水體中主要弧菌種類占有率

分別統(tǒng)計(jì)大棚和室外養(yǎng)殖池養(yǎng)殖水體不同采樣時(shí)間各種弧菌的占有率(圖2和圖3)。由圖2和圖3可知，無(wú)論大棚養(yǎng)殖池還是室外養(yǎng)殖池，均存在副溶血弧菌溶藻弧菌歐文氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維氏弧菌。大棚養(yǎng)殖池中，各種弧菌于6月14日前的占有率變化不大，之后，水體中的副溶血弧菌占有率持續(xù)升高，至采樣末期達(dá)到了56.5%；室外養(yǎng)殖池養(yǎng)殖水體中7月4日之前，各種弧菌占有率均較低(13%以下)，隨后，副溶血弧菌的占有率快速上升，至采樣末期達(dá)21.4%。

圖2 不同采樣時(shí)間內(nèi)大棚養(yǎng)殖水體中5種主要弧菌的占有率

圖3 不同采樣時(shí)間內(nèi)外塘養(yǎng)殖水體中5種主要弧菌的占有率

2.5 EHP的檢測(cè)結(jié)果

所跟蹤的養(yǎng)殖池中，對(duì)蝦感染EHP的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，養(yǎng)殖場(chǎng)于6月14日首次檢出EHP，出現(xiàn)在大棚養(yǎng)殖池G1，另外2個(gè)大棚養(yǎng)殖池分別于7月4日與24日檢出EHP。所有的4個(gè)外塘池僅在最后一次取樣時(shí)，有3個(gè)池中檢出EHP。代表性EHP檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

表4 EHP檢測(cè)結(jié)果

Tab.4 Detection results of EHP

注：G1~G3：大棚養(yǎng)殖池；W1~W4：室外養(yǎng)殖池； +：弱陽(yáng)性；++：陽(yáng)性；+++：強(qiáng)陽(yáng)性；–：陰性；/：未放苗。下同

Note: G1~G3: Ponds indoor; W1~W4: Ponds outdoor; +: Weak positive; ++: Positive;+++: Strong positive; – : Negative; / : Not stocking. The same as below

圖4 7月4日各池樣品EHP PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

A：第1輪PCR產(chǎn)物；B：第2輪PCR產(chǎn)物；M：DL2000 DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；G1~G3：大棚養(yǎng)殖池；W1~W4：室外養(yǎng)殖池；N：陰性對(duì)照；P：陽(yáng)性對(duì)照。下同

A: PCR products of first round; B: PCR products of second round; M: DL2000 DNA marker; G1~G3: Ponds indoor; W1~W4: Ponds outdoor; N: Negative control; P: Positive control. The same as below

2.6 AHPND檢測(cè)結(jié)果

AHPND跟蹤監(jiān)測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，在7月4日檢測(cè)時(shí)，所有檢測(cè)池中的對(duì)蝦AHPND均為陰性，至7月24日，除了室外養(yǎng)殖池W4外，均檢出AHPND；8月13日檢測(cè)顯示，所用跟蹤的養(yǎng)殖池中的對(duì)蝦均有AHPND檢出。代表性AHPND檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。

表5 AHPND檢測(cè)結(jié)果

Tab.5 Test results of AHPND

2.7 WSSV、IHHNV、CMNV、IMNV的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)各采樣期對(duì)蝦樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)WSSV、IHHNV、CMNV、IMNV 4種對(duì)蝦病毒，均未有出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，部分代表性PCR結(jié)果分別見(jiàn)圖6。說(shuō)明該養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦感染這4種病原的幾率很低。

圖5 7月24日各池樣品AHPND PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.8 養(yǎng)殖水體中NH4+-N及NO2–-N的濃度變化

檢測(cè)各期大棚養(yǎng)殖池及室外養(yǎng)殖池水體中NH4+-N及NO2–-N平均濃度，結(jié)果分別見(jiàn)圖7、圖8。在大棚養(yǎng)殖池中，無(wú)論NH4+-N還是NO2–-N，其變化的幅度較大，而室外養(yǎng)殖池中，變化相對(duì)平穩(wěn)。NH4+-N的最高值出現(xiàn)在7月上旬的大棚養(yǎng)殖池中，平均濃度達(dá)到(3.5±2.0) mg/L，而NO2–-N濃度在養(yǎng)殖中后期的大棚養(yǎng)殖池中持續(xù)提高，至8月14日，平均濃度已達(dá)到(8.2±0.7) mg/ml。

3 討論

近幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)外養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦病害發(fā)生較為普遍，導(dǎo)致養(yǎng)殖產(chǎn)量降低，效益下滑，而對(duì)蝦病原的多樣化給對(duì)蝦病害防控帶來(lái)了較大的難度。特別是EHP的暴發(fā)流行，給產(chǎn)業(yè)帶來(lái)的沖擊較大。EHP是一種細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，首次發(fā)現(xiàn)于泰國(guó)(Tourtip, 2009)。近年來(lái)，在中國(guó)養(yǎng)殖的日本囊對(duì)蝦()、凡納濱對(duì)蝦以及羅氏沼蝦()中也有檢出(劉珍等, 2016)，對(duì)蝦感染EHP后可導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩(Rajendran,, 2016; Chayaburakul,, 2004)。Aranguren等(2017)研究表明，對(duì)蝦感染EHP后，易受敏感性細(xì)菌的侵染。本研究結(jié)果表明，所跟蹤的養(yǎng)殖場(chǎng)，隨著養(yǎng)殖過(guò)程的持續(xù)，EHP病原存在擴(kuò)散的可能，最初的EHP發(fā)現(xiàn)于大棚養(yǎng)殖池中，至養(yǎng)殖末期，除了W1外，其他所有跟蹤的池塘中均檢出EHP感染。盡管該養(yǎng)殖場(chǎng)的養(yǎng)殖用水采用漂白粉消毒處理，但由于該養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)排水采用同一條水渠，對(duì)養(yǎng)殖廢水并沒(méi)有進(jìn)行消毒處理，為病原擴(kuò)散提供了條件。

圖6 8月13日各池樣品WSSV、IHHNV、CMNC及IMNV 4種對(duì)蝦病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

A、B分別為WSSV第1輪及第2輪PCR產(chǎn)物；C、D分別為引物389F/389R及309F/309R檢測(cè)IHHNV PCR產(chǎn)物；E、F分別為CMNV第1輪及第2輪PCR產(chǎn)物，G、H分別為IMNV第1輪及第2輪PCR產(chǎn)物

A: First round PCR products for WSSV; B: Second round PCR products for WSSV; C: PCR products for IHHNV by primer 389F/389R; D: PCR products for IHHNV by primer309F/309R; E: First round PCR products for CMNV; F: Second round PCR products for CMNV; G: First round PCR products for IMNV, H: Second round PCR products for IMNV

圖7 對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中NH4+-N濃度的變化趨勢(shì)

早期的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)蝦AHPND的發(fā)生與感染含有PirA及PirB質(zhì)粒的副溶血弧菌有關(guān)(Lee,, 2015; Tran,, 2013; 孫明玉等, 2018)，最近研究表明，對(duì)蝦感染坎氏弧菌(Han, 2017)、哈維氏弧菌(Kondo, 2015)后也表現(xiàn)出AHPND癥狀。本研究跟蹤檢測(cè)AHPND的結(jié)果顯示，在養(yǎng)殖前期(7月4日前)養(yǎng)殖場(chǎng)中并未檢測(cè)出該病菌，但在7月24日后，幾乎在所有跟蹤的養(yǎng)殖池中檢測(cè)到了AHPND的弱陽(yáng)性信號(hào)，且持續(xù)到末期感染均為弱陽(yáng)性，結(jié)合養(yǎng)殖對(duì)蝦發(fā)病特點(diǎn)及其他弧菌的檢測(cè)結(jié)果認(rèn)為，該養(yǎng)殖場(chǎng)中對(duì)蝦存在誘發(fā)AHPND的副溶血弧菌，特別是在大棚養(yǎng)殖池中，但副溶血弧菌并不是唯一導(dǎo)致對(duì)蝦發(fā)病的因素，因在養(yǎng)殖水體中及對(duì)蝦體內(nèi)也檢測(cè)出其他的致病弧菌，如溶藻弧菌、歐文氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌和哈維氏弧菌，對(duì)該類弧菌的致病力評(píng)估尚待研究。

圖8 對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中NO2--N濃度的變化趨勢(shì)

在跟蹤的7個(gè)養(yǎng)殖池中，出現(xiàn)明顯病害的3個(gè)池塘均為大棚養(yǎng)殖池，盡管所放的對(duì)蝦種苗來(lái)源及養(yǎng)殖用水與室外養(yǎng)殖池相似，因大棚養(yǎng)殖池投苗密度是室外養(yǎng)殖池的5倍，相應(yīng)的餌料投喂量也遠(yuǎn)高于室外養(yǎng)殖池，由此可導(dǎo)致水體中氨氮及亞硝基氮的濃度在養(yǎng)殖中后期出現(xiàn)超標(biāo)現(xiàn)象(圖4、圖5)，達(dá)到了危害對(duì)蝦的范圍(魏俊利等, 2012)。表明，大棚養(yǎng)殖池中水質(zhì)管理存在欠缺，導(dǎo)致養(yǎng)殖廢物排放不徹底，水質(zhì)變差。已有研究表明，較高的氨氮濃度能降低凡納濱對(duì)蝦的抵抗力(黃翔鵠等, 2006)，增加對(duì)副溶血弧菌的易感性(葛紅星等, 2014)。

綜合分析本研究所檢測(cè)的各種對(duì)蝦病原及養(yǎng)殖環(huán)境條件認(rèn)為，該凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)存在多種對(duì)蝦病原，其中，多種弧菌與EHP共感染是導(dǎo)致大棚養(yǎng)殖對(duì)蝦發(fā)病的原因之一。結(jié)合大棚養(yǎng)殖池與室外養(yǎng)殖池的發(fā)病特點(diǎn)，可以推斷，大棚養(yǎng)殖池中因放養(yǎng)密度高，水質(zhì)管理不善，氨氮及亞硝基氮濃度過(guò)高，是導(dǎo)致大棚養(yǎng)殖池對(duì)蝦發(fā)病的主要因素。本研究跟蹤調(diào)查的WSSV、IHHNV、IMNV、CMNV 4種對(duì)蝦病毒，是近年來(lái)在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中危害較為嚴(yán)重的病原，但是，在本場(chǎng)并沒(méi)有陽(yáng)性樣品檢出，表明這些病毒性病原不是該對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)的致病因子。提示在未來(lái)的對(duì)蝦養(yǎng)殖中，對(duì)EHP、細(xì)菌病的防控及水環(huán)境管理也應(yīng)引起高度的重視。

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Tracking of Shrimp Multiple Pathogens in a Shrimp Farm

WU Heying1,2, WANG Xiuhua2,3①, YANG Bing2,3, YU Danghui2, HUANG Jie2,3

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Qingdao Key Laboratory of Mariculture Epidemiology and Biosecurity, Qingdao 266071; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071)

In order to clarify the shrimp disease occurred currently in the shrimp farms, shrimp pathogens including vibrio,(EHP) and four viral pathogens(WSSV、IMNV、CMNV and IHHNV) were detected using molecular biological detect methods under a regular sampling pattern, meanwhile the concentration of ammonia nitrogen and nitrogenous nitrogen in water body were also detected. The results showed that the main pathogens in the shrimp farm comprised various pathogenic vibrio and EHP. However the shrimp virus WSSV、IMNV、CMNV and IHHNV were not detected. The vibrio species isolated and identified reached 16 totally, and the main species were,,,. Furthermore thethat could cause acute hepatopancreatic necrosis disease (VAHPND) was found out. The concentration of ammonia nitrogen and nitrate nitrogen in the indoor pond reaching (3.5±2.0) mg/L and (8.2±0.7) mg/L, were significantly higher than that in the outdoor pond respectively (< 0.05) in the medium-term (July 24) of crop cycle. The intensity of infection of VAHPNDand EHP show a growing trend in the culture period. In the seven ponds monitored, the ponds indoor had a higher incidence rate (100%), while the ponds outdoor had a lower incidence rate (25%). The results indicated that shrimp disease onset in the pond indoor might be caused by the infection of various vibrio and EHP, also the higher stocking density, higher concentration of the ammonia nitrogen and nitrate nitrogen in the water body played a synergy role in outbreak of shrimp disease. The results of this study could provide theoretical support and scientific data for the prevention and control of shrimp diseases.

; Pathogen;;(EHP); Viral pathogens; Pathogen tracking

WANG Xiuhua, E-mail: wangxh@ysfri.ac.cn

S945.1

A

2095-9869(2019)04-0104-11

10.19663/j.issn2095-9869.20180518002

* 廣西創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展專項(xiàng)(桂科AA17204044)和中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(20603022018001)共同資助[This work was supported by Guangxi Innovation-Driven Development Project (AA17204044), and Central Public- Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS(20603022018001)]. 武和英，E-mail: 1450847915@qq.com

王秀華，研究員，E-mail: wangxh@ysfri.ac.cn

2018-05-18,

2018-05-30

武和英, 王秀華, 楊冰, 于黨輝, 黃倢. 一對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)的多病原跟蹤. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2019, 40(4): 104–114

Wu HY, Wang XH, Yang B, Yu DH, Huang J. Tracking of shrimp multiple pathogens in a shrimp farm. Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(4): 104–114

(編輯 馬璀艷)