飼料中添加枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)、血清生化指標(biāo)及抗氧化能力的影響*

王成強(qiáng) 李寶山 王際英 黃炳山 孫永智 郝甜甜 馬長(zhǎng)興 周 瑩

飼料中添加枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)、血清生化指標(biāo)及抗氧化能力的影響*

王成強(qiáng)1李寶山1①王際英1黃炳山1孫永智1郝甜甜1馬長(zhǎng)興2周 瑩2

(1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 煙臺(tái) 264006；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306)

為探究飼料中添加枯草芽孢桿菌()和酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)(♀×♂)幼魚(yú)生長(zhǎng)、血清生化指標(biāo)、抗氧化能力和抗病力的影響，采用2×3雙因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在基礎(chǔ)飼料中添加0 (B0)、0.5% (B1)和1.0% (B2)的枯草芽孢桿菌制劑，同時(shí)在每個(gè)枯草芽孢桿菌水平添加0 (Y0)、0.5% (Y1)和1.0% (Y2)的酵母培養(yǎng)物，制作9組等氮、等脂的實(shí)驗(yàn)飼料，飼喂初始體重為(23.41±0.47) g珍珠龍膽石斑魚(yú)幼魚(yú)56 d。結(jié)果顯示，1)枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物的交互作用對(duì)幼魚(yú)存活率(SR)和增重率(WGR)均無(wú)顯著影響(>0.05)，幼魚(yú)WGR在Y1B1和Y2B2組處于較高水平，顯著高于對(duì)照組和Y2B2組(<0.05)。2)枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物的交互作用對(duì)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和堿性磷酸酶(AKP)影響顯著(<0.05)，血清ALT和AKP活力在Y1B1和Y1B2組處于較低水平，且顯著低于對(duì)照組和Y2B2組(<0.05)。3)枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物的交互作用對(duì)腸道超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量影響顯著(<0.05)。腸道SOD、過(guò)氧化氫酶(CAT)活力和總抗氧化能力(T-AOC)在Y1B1和Y1B2組處于較高水平，顯著高于對(duì)照組和Y2B2組(<0.05)，而MDA含量同SOD活力呈相反的變化趨勢(shì)(<0.05)。4)枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物的交互作用對(duì)鰻弧菌()攻毒后幼魚(yú)累積存活率無(wú)顯著影響(>0.05)。鰻弧菌攻毒后幼魚(yú)累積存活率在Y1B1組最高，顯著高于對(duì)照組(<0.05)。

珍珠龍膽石斑魚(yú)；枯草芽孢桿菌；酵母培養(yǎng)物；生長(zhǎng)；抗氧化能力；抗病力

長(zhǎng)期以來(lái)，人們多用抗生素來(lái)控制和預(yù)防水產(chǎn)疾病的發(fā)生，但由于抗生素類藥物易殘留，污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，并能夠通過(guò)食物鏈影響人類健康。同時(shí)，隨著無(wú)抗養(yǎng)殖目標(biāo)的提出，抗生素的使用已被嚴(yán)重限制。益生菌由于具有促進(jìn)生長(zhǎng)、提高飼料利用率、抵御病原體和改善水質(zhì)等自身優(yōu)勢(shì)，且安全性好，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中(Nayak, 2010)。其中，枯草芽孢桿菌()被公認(rèn)為是一種具有優(yōu)良作用的益生菌，能夠在動(dòng)物腸道內(nèi)繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶等多種酶類，并且性能穩(wěn)定，在金頭鯛(L.) (Cerezuela, 2013)、卡特拉魚(yú)() (Sangma, 2015)、凡納濱對(duì)蝦() (Liu, 2010)等水產(chǎn)動(dòng)物的研究中均表明，其能夠促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)，增強(qiáng)免疫能力。

酵母培養(yǎng)物(Yeast culture)主要含有酵母細(xì)胞本身和細(xì)胞外代謝物，特別是其代謝物，能為消化道微生物提供豐富的營(yíng)養(yǎng)，如：肽、有機(jī)酸、寡糖(β-葡聚糖及甘露寡糖)、氨基酸等(郁歡歡等，2015)，成為當(dāng)前水產(chǎn)飼料中使用較為廣泛的添加劑。在團(tuán)頭魴() (李高鋒, 2009)、異育銀鯽() (徐磊等, 2010)、羅氏沼蝦() (粟雄高等, 2012)等水產(chǎn)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中均表明，酵母培養(yǎng)物不僅能促進(jìn)生長(zhǎng)和胃腸道的消化與吸收，還能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，提高抗病力。

近年來(lái)，隨著珍珠龍膽石斑魚(yú)(♀×♂)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，弧菌感染等病害問(wèn)題成為影響石斑魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要問(wèn)題。同時(shí)研究證實(shí)，水產(chǎn)動(dòng)物原籍菌適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境能力強(qiáng)，更易于在動(dòng)物體內(nèi)增殖和定植，作為微生態(tài)制劑效果更為顯著(楊紅玲等, 2012)。鑒于此，本研究擬從健康珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道中分離出能較好適應(yīng)魚(yú)體腸道環(huán)境、產(chǎn)酶能力強(qiáng)、可供飼用的芽孢桿菌菌株，并進(jìn)行保種發(fā)酵，探討飼料中添加原籍芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)、血清生化指標(biāo)、腸道抗氧化能力及抗弧菌感染能力的影響，以期為珍珠龍膽石斑魚(yú)生物飼料的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 芽孢桿菌制劑的制備和飼料制作

實(shí)驗(yàn)從健康珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道細(xì)菌中分離和培養(yǎng)枯草芽孢桿菌菌種，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，制成枯草芽孢桿菌制劑，作為飼料添加劑。實(shí)驗(yàn)方法參考賀國(guó)龍等(2017)的方法，并稍作修改，步驟如下：無(wú)菌條件下，取珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道，置于離心管中，將其剪碎勻漿，制成原液，將原液置于70℃恒溫水浴鍋中水浴30 min，之后將高溫處理后的原液按照1∶10稀釋后，涂布于瓊脂培養(yǎng)皿上，然后37℃培養(yǎng)24 h。之后挑選瓊脂培養(yǎng)皿上單個(gè)灰白色、菌落邊緣不規(guī)則、不整齊、表面粗糙而干燥的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，并制作成斜面后做進(jìn)一步鑒定。將斜面保存的菌種進(jìn)行16S rDNA菌種鑒定，同時(shí)參考東秀珠等(2001)的方法進(jìn)行生理生化鑒定，采用平板透明圈法，進(jìn)行菌株產(chǎn)酶能力分析，篩選出產(chǎn)酶能力強(qiáng)的枯草芽孢桿菌菌株，最后將篩選的枯草芽孢桿菌菌株經(jīng)發(fā)酵、干燥、混合，制成干菌粉(活菌數(shù)2.0×109CFU/g)，玉米淀粉作為載體。

以魚(yú)粉、酪蛋白和發(fā)酵豆粕為主要蛋白質(zhì)源，魚(yú)油和大豆卵磷脂為主要脂肪源，配制粗蛋白質(zhì)含量52%，粗脂肪含量11%的基礎(chǔ)飼料。采用2×3雙因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別在基礎(chǔ)飼料中添加0 (B0)、0.5% (B1)和1.0% (B2)的枯草芽孢桿菌制劑，同時(shí)在每個(gè)枯草芽孢桿菌水平添加0 (Y0)、0.5% (Y1)和1.0% (Y2)的酵母培養(yǎng)物(徐州賽博生物科技有限公司提供)，共制成9組等氮、等脂的實(shí)驗(yàn)飼料，分別記為：Y0B0 (0)、Y0B1 (4.15×106CFU/g)、Y0B2 (8.04×106CFU/g)、Y1B0 (0)、Y1B1 (4.03×106CFU/g)、Y1B2 (7.95×106CFU/g)、Y2B0 (0)、Y2B1 (3.89×106CFU/g)和Y2B2 (8.24× 106CFU/g)，Y0B0組為對(duì)照組，飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。制作飼料時(shí)，先將所有原料粉碎后過(guò)80目標(biāo)準(zhǔn)篩，按配比稱重后混勻，加入魚(yú)油與干粉充分混勻之后，加入適量的蒸餾水混合均勻，最后用小型顆粒飼料擠壓機(jī)制成2種型號(hào)(直徑分別為2.5 mm和 3.5 mm)的飼料顆粒，60℃烘干，飼料袋包裝后，置于通風(fēng)干燥處儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)及實(shí)驗(yàn)管理

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在山東省海洋資源與環(huán)境研究院東營(yíng)實(shí)驗(yàn)基地循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)用魚(yú)為該基地當(dāng)年繁育的同一批珍珠龍膽石斑魚(yú)幼魚(yú)，實(shí)驗(yàn)周期為56 d。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，先用對(duì)照組飼料暫養(yǎng)15 d，使其充分適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。正式實(shí)驗(yàn)前，將實(shí)驗(yàn)魚(yú)饑餓24 h，挑選大小均勻、體色健康的珍珠龍膽石斑魚(yú)幼魚(yú)[平均體重為(23.41±0.47) g]，隨機(jī)放養(yǎng)于18個(gè)養(yǎng)殖桶(70 cm×80 cm)中，每個(gè)桶內(nèi)放30尾幼魚(yú)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3個(gè)重復(fù)。養(yǎng)殖期間，每天在08:30和16:30飽食投喂2次，投喂30 min后吸出殘餌，并記錄殘餌數(shù)量。水溫控制在(28±1)℃，溶氧>6.3 mg/L，鹽度為23.5~26.5，pH為7.5~8.0，氨氮和亞硝酸氮含量均<0.1 mg/L。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分(干物質(zhì), %)

Tab.1 Formulation and proximate composition of experimental diets (Dry matter, %)

注：1. 維生素混合料(mg/kg or IU/kg飼料)：維生素A，7500.0 IU；維生素D，1500.0 IU；維生素E，60.0 mg；維生素K3，18.0 mg；維生素B1，12.0 mg；維生素B2，12.0 mg；維生素B12，0.1 mg；泛酸，48.0 mg；煙酰胺：90.0 mg；葉酸，3.7 mg；D-生物素：0.2 mg；肌醇，60.0 mg；維生素C，310.0 mg

2. 礦物質(zhì)混合料(mg/kg飼料)：鋅，35.0 mg；錳，21.0 mg；銅，8.3 mg；鐵，23.0 mg；鈷，1.2 mg；碘，1.0 mg；硒，0.3 mg

Note: 1. Vitamin premix (mg/kg or IU/kg diet): vitamin A 7500.0 IU, vitamin D 1500.0 IU, vitamin E 60.0 mg, vitamin K318.0 mg, vitamin B112.0 mg, vitamin B212.0 mg, vitamin B120.1 mg, pantothenate acid 48.0 mg, nicotinamide 90 mg, folic acid 3.7 mg, D-biotin 0.2 mg, inositolum 60.0 mg, vitamin C 310.0 mg

2. Mineral premix (mg/kg diet): Zn 35.0 mg, Mn 21.0 mg, Cu 8.3 mg, Fe 23.0 mg, Co 1.2 mg, I 1.0 mg, Se 0.3 mg

1.3 樣品收集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)魚(yú)饑餓24 h，從每個(gè)養(yǎng)殖桶內(nèi)隨機(jī)取5尾魚(yú)進(jìn)行解剖，分離出腸道組織，放入離心管中后迅速轉(zhuǎn)移到液氮中速凍。之后再?gòu)拿總€(gè)養(yǎng)殖桶中隨機(jī)取5尾魚(yú)，用無(wú)菌注射器，采用尾部靜脈取血法進(jìn)行取血，取出血液4℃靜置4 h，3000 r/min離心10 min，小心將血清吸出后，之后迅速放入液氮中。樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，轉(zhuǎn)移到–80℃超低溫冰箱中保存，用于后期實(shí)驗(yàn)分析。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)

存活率(Survival rate, SR，%)=100×終末尾數(shù)/初始尾數(shù)；

增重率(Weight gain rate, WGR，%)=100×(終末體重–初始體重)/初始體重

1.4.2 血清生化指標(biāo) 血清中的生化指標(biāo)均采用日立自動(dòng)生化分析儀(7020型，Hitachi，日本)測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)主要包括：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Cereal third transaminase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate transaminase, AST)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、白蛋白(Albumin, ALB)。

1.4.3 腸道抗氧化指標(biāo) 腸道超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase, CAT)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)以及總抗氧化能力(Total antioxidant capacity, T-AOC)均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定，酶活定義及具體測(cè)定步驟參照試劑盒說(shuō)明。

1.4.4 人工攻毒實(shí)驗(yàn) 用本實(shí)驗(yàn)室保存并經(jīng)過(guò)鑒定的鰻弧菌()菌株進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)確定半致死濃度，參照馬愛(ài)軍等(2014)方法略有修改。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)養(yǎng)殖桶中取8尾魚(yú)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，腹腔注射半致死濃度(5×108CFU/ml)菌液，按照50 g體重腹腔注射50 μl生理鹽水懸浮的鰻弧菌菌液，分別記錄注射后1、24、48、72和96 h的死亡情況，并及時(shí)撈出死魚(yú)，計(jì)算累積存活率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One- way ANOVA)，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)來(lái)表示所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，另外用Tukey’s檢驗(yàn)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，當(dāng)<0.05時(shí)，表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響

由表2可知，幼魚(yú)SR介于91.11%~98.89%，不同實(shí)驗(yàn)組間無(wú)顯著差異(>0.05)，枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)幼魚(yú)存活率的影響沒(méi)表現(xiàn)出顯著的交互作用(>0.05)。在每個(gè)酵母培養(yǎng)物添加水平，飼料中添加枯草芽孢桿菌后，幼魚(yú)WGR顯著高于未添加組(<0.05)，且在添加組間無(wú)顯著差異(>0.05)。在每個(gè)枯草芽孢桿菌添加水平，隨著飼料中酵母培養(yǎng)物添加量的增加，幼魚(yú)WGR先升高后降低，在0.5%添加組幼魚(yú)的WGR最高，顯著高于未添加組和1.0%添加組(<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，幼魚(yú)WGR在Y1B1和Y2B2組處于較高水平，顯著高于對(duì)照組和Y2B2組(<0.05)，而枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)幼魚(yú)WGR沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的交互作用(>0.05)。

2.2 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)幼魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，在每個(gè)酵母培養(yǎng)物添加水平，隨著飼料中枯草芽孢桿菌添加量的增加，幼魚(yú)血清ALT活力先降低后升高(<0.05)，且在添加組間無(wú)顯著性差異(>0.05)。在每個(gè)枯草芽孢桿菌水平，飼料中添加酵母培養(yǎng)物，幼魚(yú)血清ALT活力也呈先降低后升高趨勢(shì)，但是僅在枯草芽孢桿菌為1.0%水平時(shí)，不同實(shí)驗(yàn)組血清ALT活力有顯著性差異(<0.05)。枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)血清中ALT活力沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的交互作用(>0.05)。血清ALT活力在Y1B1實(shí)驗(yàn)組達(dá)到最低值，顯著低于對(duì)照組和Y2B2組(<0.05)。幼魚(yú)血清AST活力呈現(xiàn)同ALT相似的變化趨勢(shì)，但枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)血清中AST活力的影響表現(xiàn)出顯著的交互作用(<0.05)。

枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)血清AKP活力的影響沒(méi)表現(xiàn)出顯著的交互作用(>0.05)，血清AKP活力在Y1B1實(shí)驗(yàn)組達(dá)到最低值，顯著低于對(duì)照組和Y2B2組(<0.05)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，幼魚(yú)血清ALB含量在不同實(shí)驗(yàn)組均無(wú)顯著性差異(>0.05)。

表2 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)幼魚(yú)生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

Tab.2 Effects of dietary B. subtilis and yeast culture on the growth indices of juveniles

注：表中同列肩標(biāo)相同小寫(xiě)字母或無(wú)字母表示差異不顯著(>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(<0.05)，下表同

Note: In the same row, values with same small letter superscripts or no letter superscripts mean no significant differences (>0.05), different small letter superscripts mean significant differences (>0.05), the same as the following

表3 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)幼魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響

Tab.3 Effects of dietary B. subtilis and yeast culture on the serum biochemical indices of juveniles

2.3 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)幼魚(yú)腸道抗氧化能力的影響

表4顯示，枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)腸道SOD活力的影響，表現(xiàn)出顯著交互作用(<0.05)。在每個(gè)酵母培養(yǎng)物水平，飼料中添加枯草芽孢桿菌提高了幼魚(yú)腸道SOD活力，在0.5%枯草芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)組腸道SOD活力最高，顯著高于未添加組(<0.05)。當(dāng)枯草芽孢桿菌添加水平為0.5%和1.0%時(shí)，飼料中添加0.5%酵母培養(yǎng)物能夠顯著提高腸道SOD活力(<0.05)。腸道SOD活力在Y1B1組達(dá)到最高值，顯著高于對(duì)照組和Y2B2組(<0.05)。飼料中添加枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物，對(duì)幼魚(yú)腸道CAT和T-AOC影響同SOD具有相似的變化趨勢(shì)(<0.05)，而枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)腸道CAT活力和T-AOC的影響無(wú)顯著交互作用(>0.05)。

表4 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)幼魚(yú)腸道抗氧化能力的影響

Tab.4 Effects of dietary B. subtilis and yeast culture on the antioxidant capacity in intestine of juveniles

當(dāng)酵母培養(yǎng)物水平為0.5%時(shí)，飼料中添加枯草芽孢桿菌顯著降低了腸道MDA含量(<0.05)；而當(dāng)酵母培養(yǎng)物水平為1.0%時(shí)，0.5%枯草芽孢桿菌添加組幼魚(yú)腸道MDA含量顯著低于未添加組和1.0%水平組(<0.05)，未添加組和1.0%水平組無(wú)顯著性差異(<0.05)。腸道MDA含量在Y1B2組達(dá)到最低值?？莶菅挎邨U菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)腸道MDA含量的影響表現(xiàn)出顯著交互作用(<0.05)。

2.4 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)鰻弧菌攻毒后幼魚(yú)累積存活率的影響

表5顯示，在每個(gè)酵母培養(yǎng)物水平，飼料中添加枯草芽孢桿菌提高了鰻弧菌攻毒后幼魚(yú)的存活率，在枯草芽孢桿菌水平為0.5%時(shí)，累積存活率顯著高于未添加組(<0.05)。在每個(gè)枯草芽孢桿菌水平，飼料中添加酵母培養(yǎng)物的幼魚(yú)累積存活率有一定增加，但各處理組間無(wú)顯著性影響(>0.05)。鰻弧菌攻毒后珍珠龍膽石斑魚(yú)幼魚(yú)累積存活率在Y1B1組最高，顯著高于對(duì)照組(<0.05)。枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)幼魚(yú)累積存活率的影響沒(méi)有顯著的交互作用(>0.05)。

表5 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)鰻弧菌攻毒后幼魚(yú)累積存活率的影響

Tab.5 Effects of dietary B. subtilis and yeast culture on the cumulative survival rate of juveniles challenged with V. anguillarum

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響

研究結(jié)果顯示，當(dāng)飼料中添加0.5%酵母培養(yǎng)物、0.5%或1.0%枯草芽孢桿菌時(shí)，珍珠龍膽石斑魚(yú)幼魚(yú)能夠獲得較高的WGR，表明飼料中添加適宜水平的酵母培養(yǎng)物和枯草芽孢桿菌，能對(duì)魚(yú)體生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著地促進(jìn)作用。Liu等(2012)在斜帶石斑魚(yú)、劉曉勇等(2011)在雜交鱘(♂×♀)、 朱學(xué)芝等(2007)在凡納濱對(duì)蝦的研究中均表明，適量枯草芽孢桿菌能夠提高魚(yú)體的生長(zhǎng)性能。另外，何遠(yuǎn)法等(2016)研究證實(shí)，飼料中添加0.30%~0.50%酵母培養(yǎng)物能夠顯著提高凡納濱對(duì)蝦的WGR；姚世彬等(2014)在草魚(yú)()研究中也表明，酵母培養(yǎng)物在促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng)方面具有積極作用。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能是，酵母培養(yǎng)物中含有豐富的氨基酸、葡萄糖、維生素、有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及一些未知促生長(zhǎng)因子，可以為腸道內(nèi)微生物菌群的生長(zhǎng)和代謝提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)有益菌群的代謝和活力，抑制大腸桿菌等有害菌的繁殖，從而優(yōu)化腸道微生物結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了機(jī)體健康水平(郁歡歡等, 2015)。再加上本實(shí)驗(yàn)添加的是原籍枯草芽孢桿菌，在酵母培養(yǎng)物的基礎(chǔ)上，能夠更好地在腸道內(nèi)定植和繁殖，這也就暗示二者在功能上可能形成相互協(xié)同的作用，從而能對(duì)幼魚(yú)的生長(zhǎng)產(chǎn)生積極效應(yīng)。

然而，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，當(dāng)二者添加量較高(1.0%和1.0%)時(shí)，幼魚(yú)WGR會(huì)受到抑制，這可能是由于高劑量添加容易引起腸道微生態(tài)系統(tǒng)失衡，腸道黏膜遭到破壞，導(dǎo)致機(jī)體的免疫能力下降，進(jìn)而影響了幼魚(yú)的生長(zhǎng)(何遠(yuǎn)法等, 2016)。其相關(guān)原因在討論中將作進(jìn)一步論述。

3.2 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)幼魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響

研究表明，枯草芽孢桿菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫機(jī)能具有明顯促進(jìn)效果。程遠(yuǎn)等(2014)在飼料中添加0.12%~0.18%，即2.82×1010~4.23×1010CFU/kg的枯草芽孢桿菌時(shí)，吉富羅非魚(yú)()血清AST、ALT和AKP活力均有不同程度的下降，機(jī)體免疫功能得到顯著提高；董春光等(2015)報(bào)道，飼料中適量的枯草芽孢桿菌能夠顯著增強(qiáng)刺參()的非特異性免疫酶(SOD、AKP、CAT)活力，提高刺參的非特異性免疫能力。本研究中，在每個(gè)酵母培養(yǎng)物水平上，各實(shí)驗(yàn)組血清AST、ALT和AKP活力均在枯草芽孢桿菌添加量為0.5%時(shí)最低，且顯著低于未添加組(<0.05)。這同上述研究結(jié)果一致，說(shuō)明飼料中適量的枯草芽孢桿菌能夠?qū)Ω闻K起到一定的保護(hù)作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能是，添加進(jìn)飼料中的原籍枯草芽孢桿菌進(jìn)入腸道中，更易在腸道內(nèi)定植并迅速繁殖，從而能夠在腸道內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)性抑制其他有害菌的生存，改善腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)，從而能夠間接增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能(惠明等, 2008)。

研究報(bào)道，在飼料中添加適宜的酵母培養(yǎng)物能夠維持異育銀鯽血清AST和ALT活力水平，有益于魚(yú)體正常肝功能運(yùn)轉(zhuǎn)(康學(xué)會(huì)等, 2017)；同時(shí)，何遠(yuǎn)法等(2016)在凡納濱對(duì)蝦的研究中表明，飼料中添加0.30%~0.50%酵母培養(yǎng)物，能夠顯著影響血清中溶菌酶、酚氧化酶和堿性磷酸酶活力，顯著提高凡納濱對(duì)蝦的非特異性免疫力。本研究結(jié)果也表明，飼料中添加0.5%酵母培養(yǎng)物能夠顯著降低血清AST、ALT和AKP活力，提高機(jī)體非特異性免疫能力。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酵母培養(yǎng)物添加量為1.0%時(shí)，幼魚(yú)血清中免疫指標(biāo)活力受到了抑制，顯著低于0.5%添加組。這同在凡納濱對(duì)蝦的研究結(jié)果類似，當(dāng)酵母培養(yǎng)物的添加量超過(guò)一定量時(shí)，凡納濱對(duì)蝦免疫能力并不能得到進(jìn)一步的改善，而是產(chǎn)生了一定的負(fù)面影響(何遠(yuǎn)法等, 2016)。這可能是酵母培養(yǎng)物中含有非淀粉多糖的原因?qū)е碌?，非淀粉多糖具有抗?fàn)I養(yǎng)的作用，隨著添加量的增加，飼料中非淀粉多糖含量也隨之增高，從而影響了魚(yú)體對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的吸收，導(dǎo)致維持體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)素減少(邱燕, 2010)，進(jìn)而可能導(dǎo)致機(jī)體免疫能力降低，但其具體原因有待于進(jìn)一步研究。

根據(jù)分析，本研究中枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物在血清AST和AKP上表現(xiàn)出顯著的交互作用(< 0.05)。研究結(jié)果表明，當(dāng)飼料中枯草芽孢桿菌為0.5%、酵母培養(yǎng)物為0.5%或1.0%時(shí)，與對(duì)照組相比，幼魚(yú)血清中AST、ALT和AKP活力均處于較低水平，表現(xiàn)出較高的免疫能力，同時(shí)在這一添加量下，幼魚(yú)WGR也處于較高水平。這也說(shuō)明適宜水平的枯草芽孢桿菌同酵母培養(yǎng)物存在協(xié)同作用，能夠在一定程度上維持血清中免疫指標(biāo)的活力，提高魚(yú)體的免疫能力和生長(zhǎng)性能。

3.3 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)幼魚(yú)抗氧化能力的影響

機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱與機(jī)體健康程度存在密切的關(guān)系，SOD、CAT和T-AOC是體內(nèi)關(guān)鍵性的抗氧化酶。其中，SOD能夠清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，T-AOC可以反映機(jī)體對(duì)外來(lái)刺激的代償能力以及機(jī)體自由基代謝的狀態(tài)(張滕閑等, 2017; 劉玲等, 2018)。在斜帶石斑魚(yú)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，投喂添加枯草芽孢桿菌飼料能夠顯著提高血清中SOD、CAT的活力(Liu, 2012)；劉曉勇等(2011)在飼料中添加0.25%枯草芽孢桿菌，雜交鱘血清中SOD活力和T-AOC水平得到顯著提高。另外在黑鯛()幼魚(yú)(李盈鋒等, 2014)、海參(Fan, 2013)等研究中均證實(shí)，枯草芽孢桿菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物抗氧化能力具有一定的增強(qiáng)作用。本研究結(jié)果表明，當(dāng)飼料中添加0.5%枯草芽孢桿菌時(shí)，能夠顯著提高幼魚(yú)腸道SOD、CAT活力和T-AOC水平，同時(shí)能有效降低腸道MDA含量，這可能是因?yàn)楫?dāng)枯草芽孢桿菌隨飼料進(jìn)入魚(yú)體后，可通過(guò)自身分泌抗氧化酶或作為激活劑促進(jìn)機(jī)體抗氧化酶分泌，從而增強(qiáng)了魚(yú)體清除自由基的能力和降低脂質(zhì)過(guò)氧化程度，提高了幼魚(yú)的抗氧化能力，這同上述研究結(jié)果類似。

本研究表明，在添加枯草芽孢桿菌的基礎(chǔ)上，添加0.5%的酵母培養(yǎng)物能夠顯著提高SOD、CAT活力和T-AOC水平，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，同時(shí)能夠降低MDA含量。這可能與酵母培養(yǎng)物中含有β-葡聚糖和甘露寡糖(MOS)等有關(guān)，研究表明，二者在提高機(jī)體的抗氧化能力和抗病力方面均能顯著作用(Meshram, 2015)。β-葡聚糖能夠激活機(jī)體先天性免疫和獲得性免疫過(guò)程，能夠直接結(jié)合并激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等白細(xì)胞，提高集體的免疫能力(Herre, 2004)；MOS能夠顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物溶菌酶活力、頭腎細(xì)胞吞噬活性及促進(jìn)前列腺素的分泌等，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫能力(Staykov, 2007)。徐磊等(2010)在異育銀鯽、姚世彬等(2014)在草魚(yú)等的研究中均表明，酵母培養(yǎng)物在增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，提高非特異性免疫方面具有積極的作用。

本研究結(jié)果顯示，幼魚(yú)腸道SOD活力和MDA含量受枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物的交互作用影響顯著，當(dāng)酵母培養(yǎng)物為0.5%，枯草芽孢桿菌為0.5%和1.0%時(shí)，SOD活力處于較高水平，顯著高于對(duì)照組與Y2B2組，MDA含量顯著低于對(duì)照組與Y2B2組。這表明飼料中適宜的枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物配比能夠在提高珍珠龍膽石斑魚(yú)幼魚(yú)抗氧化水平，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力方面具有一定的協(xié)同作用。

3.4 枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)幼魚(yú)抗病力的影響

眾多報(bào)道已證實(shí)，枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物能夠顯著改善水產(chǎn)動(dòng)物的抗病力。研究表明，當(dāng)飼料中添加適量枯草芽孢桿菌時(shí)，斑節(jié)對(duì)蝦對(duì)哈維氏弧菌()的抗感染能力增強(qiáng)(Sirirat, 2000)，凡納濱對(duì)蝦對(duì)溶藻弧菌()的抗感染能力增強(qiáng)(粟雄高等, 2012)。同時(shí)，在條紋鱸() (Li, 2004)、尼羅非魚(yú)(Mohsen, 2008)等研究中均也表明，枯草芽孢桿菌能夠降低攻毒后水產(chǎn)動(dòng)物的累積死亡率。另外， 張琴(2010)報(bào)道，刺參攝食含有酵母培養(yǎng)物的飼料后，可以顯著降低其感染弧菌后的累積死亡率，提高抗病力；同時(shí)，在牙鲆()(溫俊, 2007)和凡納濱對(duì)蝦(Burgents, 2004)中的實(shí)驗(yàn)中也表明，酵母培養(yǎng)物能夠提高二者在弧菌感染后的成活率。本研究中，飼料中添加枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物，均能夠提高鰻弧菌攻毒后珍珠龍膽石斑魚(yú)幼魚(yú)的存活率，這也同上述眾多研究結(jié)果一致，再次證實(shí)了枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物能夠提高魚(yú)體的抗病力。這可能是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌和酵母培養(yǎng)物能夠調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，對(duì)入侵微生物及病害具有很強(qiáng)的拮抗作用，發(fā)揮出一定的免疫活性作用，來(lái)刺激體內(nèi)免疫系統(tǒng)的發(fā)育，進(jìn)而對(duì)機(jī)體抗氧化能力具有提高作用(曹海鵬, 2013)。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物雖然在攻毒后幼魚(yú)存活率上沒(méi)有顯著地交互作用，但是當(dāng)酵母培養(yǎng)物為0.5%，枯草芽孢桿菌為0.5%或1.0%時(shí)，幼魚(yú)存活率顯著高于對(duì)照組和Y2B2組，這說(shuō)明在適當(dāng)?shù)奶砑恿肯?，二者功能上可能存在一定的協(xié)同作用，共同提高機(jī)體免疫能力和抗病力，這一觀點(diǎn)在上述幼魚(yú)生長(zhǎng)、血清免疫指標(biāo)及腸道抗氧化能力上也得到了類似的論述。

4 結(jié)論

綜上所述，當(dāng)飼料中添加適量的枯草芽孢桿菌(0.5%或1.0%)和酵母培養(yǎng)物(0.5%)時(shí)，能夠提高幼魚(yú)WGR和血清中部分免疫指標(biāo)的活力，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力和降低鰻弧菌感染后幼魚(yú)的死亡率，提高魚(yú)體的抗病力。同時(shí)也表明，枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物在提高幼魚(yú)非特異性免疫方面可能存在一定的協(xié)同作用。

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Effects of Dietaryand Yeast Culture on Growth, Serum Biochemical Indices and Antioxidant Capacity of Juvenile Hybrid Grouper (♀ ×♂)

WANG Chengqiang1, LI Baoshan1①, WANG Jiying1, HUANG Bingshan1, SUN Yongzhi1, HAO Tiantian1, MA Changxing2, ZHOU Ying2

(1. Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Shandong Key Laboratory of Marine Ecological Restoration, Yantai 264006;2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

A 2×3 two-factorial experiment was designed to investigate the effects of dietary administration ofand yeast culture on growth, serum biochemical indices, antioxidant capacity, and disease resistance of juvenile hybrid grouper (♀×♂) [initial weight: (23.41±0.47) g]. Nine isonitrogenous and isoenergetic diets were formulated with three levels of[0 (control), 0.5%, and 1.0%], and eachlevel was formulated with three yeast culture levels [0 (control), 0.5%, and 1.0%]. Juvenile hybrid groupers were fed for 8 weeks. The results showed that the interaction betweenand yeast culture had no significant effects on the survival (SR) and weight gain rate (WGR) of grouper (>0.05). The WGR of Y1B1 and Y1B2 groups was significantly higher than that of the control and Y2B2 groups (<0.05).The interaction betweenand yeast culture had a significant effect on the aspartate aminotransferase (AST) and alkaline phosphatase (AKP) in the serum of grouper (<0.05); the AST and AKP activities in the serum of Y1B1 and Y1B2 groups were significantly lower than those in the control and Y2B2 groups (<0.05). The interaction betweenand yeast culture had a significant effect on the superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) levels in the intestinal tract of grouper (<0.05), but no significant interaction with catalase (CAT) or total antioxidant capacity (T-AOC) in the intestinal tract (>0.05). The activities of SOD, CAT, and T-AOC in the intestinal tract of the Y1B1 and Y1B2 groups were significantly higher than those in the control and Y2B2 groups (<0.05), but the MDA content in the intestinal tract showed an opposite trend to SOD (<0.05). There was no interaction between the effects of dietaryand yeast culture on the cumulative survival rate of juveniles challenged with(>0.05). The highest value of cumulative survival rate of juveniles was found in the Y1B1 group, which was significantly higher than that in the control group (<0.05). In conclusion, supplementation of 0.5% or 1.0%and 0.5% yeast culture in diets could promote WGR, antioxidant capacity, and disease resistance in juvenile hybrid grouper.

♀♂;; Yeast culture; Growth; Antioxidant capacity; Disease resistance

LI Baoshan, E-mail: bsleeyt@126.com

S963

A

2095-9869(2019)04-0047-10

10.19663/j.issn2095-9869.20180529001

* 煙臺(tái)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016ZH068)、山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016GSF115005)和山東省自然科學(xué)基金(ZR2015CQ023)共同資助[This work was supported by Science and Technology Development Plan of Yantai (2016ZH068), Key Research and Development Project of Shandong Province (2016GSF115005), and Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2015CQ023)]. 王成強(qiáng), E-mail: chengqiangwang@ 126.com

李寶山，E-mail: bsleeyt@126.com

2018-05-29,

2018-06-21

王成強(qiáng), 李寶山, 王際英, 黃炳山, 孫永智, 郝甜甜, 馬長(zhǎng)興, 周瑩. 飼料中添加枯草芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)、血清生化指標(biāo)及抗氧化能力的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2019, 40(4): 47–56

Wang CQ, Li BS, Wang JY, Huang BS, Sun YZ, Hao TT, Ma CX, Zhou Y. Effects of dietaryand yeast culture on growth, serum biochemical indices and antioxidant capacity of juvenile hybrid grouper (♀♂). Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(4): 47–56

(編輯 陳輝)