UPLC-MS/MS 測定減肥類中藥制劑及保健食品中的4種非法添加成分

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（1新建區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，江西 南昌 330100；2南昌市食品藥品檢驗所，330038）

UPLC-MS/MS 測定減肥類中藥制劑及保健食品中的4種非法添加成分

涂鳳蓮1汪元符2

（1新建區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，江西 南昌 330100；2南昌市食品藥品檢驗所，330038）

目的：針對減肥類中藥制劑及保健食品，建立了可能非法添加的酚酞、西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明等4種成分的超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用的檢測方法。方法：色譜柱為Phenomenex Luna C18（2）100A（150 mm×2.00 mm，3 μm）；柱溫為35℃；流動相為10 mmol/L乙酸銨（以乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.0）及乙腈，梯度洗脫；流速為0.2 mL/min；以優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)采集信號。結(jié)果：各成分檢出限濃度為0.1～ 0.2 ng/mL；定量限濃度為0.3～ 0.5 ng/mL；線性范圍為各成分定量限～ 100 ng/mL；在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均在0.99以上；平均加樣回收率為94.2%～ 101.5%。結(jié)論：本方法簡便，快速，準(zhǔn)確，靈敏度高，專屬性好，能用于減肥類中藥制劑及保健食品中非法添加的快速檢測。

超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用；酚酞；西布曲明；N-單去甲基西布曲明；N，N-雙去甲基西布曲明；非法添加

在日常檢測工作實踐中，減肥類中藥制劑及保健食品非法添加違禁藥物成分的情況時有發(fā)生?；诩訌?qiáng)檢測能力，提高檢測方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、精確度的原因，本實驗室建立了有效的超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS/MS），在定性確認(rèn)的同時測定可能非法添加的酚酞、西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明等4種成分的含量，能夠滿足平時的監(jiān)督檢驗需要。

1儀器、試劑與材料

AB Sciex 4000 Qtrap質(zhì)譜，ekspert ultraLC100高效液相色譜儀，METTLER TOLEDO ME204E電子分析天平，METTLER TOLEDO XS105電子分析天平，昆山KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器，TG16-WS臺式高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)），Millipore超純水系統(tǒng)。

甲醇（色譜純，Merck）、乙腈（色譜純，Merck），冰乙酸（色譜純，麥克林A801303-500 mL），乙酸銨（優(yōu)級純，麥克林A800998-500 g）。

對照品：酚酞（100091-199601）、鹽酸西布曲明（100624-200401）、鹽酸 N-單去甲基西布曲明（520002-201301）、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明（520001-201301），均為中國食品藥品檢定研究院提供。

樣品：購自流通或醫(yī)療機(jī)構(gòu)。中藥制劑8批：體美減肥膠囊（規(guī)格：0.3 g，批號：130607），福瑞堂輕身減肥膠囊（規(guī)格：0.35 g，批號：131005），靚爾娜輕身減肥片（規(guī)格：108片，批號：130722），永孜堂降脂減肥片（規(guī)格：36片，批號：130301），堂旨舒降脂減肥片（規(guī)格：72片，批號：130722），形美輕身減肥片（規(guī)格：48片，批號：131015），同仁堂輕身消胖丸（規(guī)格：240粒，每100粒約重15 g，批號：130705），中一牌防風(fēng)通圣丸（規(guī)格：6 g，批號：130701）。保健食品13批：輕身樂減肥膠囊（規(guī)格：0.20 g，批號：14070301），蜀寶減肥膠囊（規(guī)格：200 mg，批號：20150310），紐斯葆婷采減肥靚顏膠囊（規(guī)格：0.3 g，批號：FC158），美澳健秀中秀減肥膠囊（規(guī)格：0.4 g，批號：15202002），金奧力綠茶肉堿膠囊（規(guī)格：0.42 g，批號：14041901），康乃馨殼聚糖左旋肉堿荷葉片（0.7 g，批號：150401），奧斯萊康惠普生纖纖片（規(guī)格：600 mg，批號：20150301），湯臣倍健左旋肉堿茶多酚荷葉片（規(guī)格：1 220 mg，批號：20140514A），紐斯葆綠荷片（規(guī)格：0.4 g，批號：EC678），碧生源減肥茶（規(guī)格：2.5 g，批號：04150106），瑞德夢減肥茶（規(guī)格：2.5 g，批號：140106），半生緣天信減肥茶（規(guī)格：3 g，批號：141018），鄭氏膳食素（規(guī)格：250 mg/粒，批號：20141010）。

2方法與結(jié)果

2.1高效液相色譜分析條件

分析柱：Phenomenex Luna C18（2）100A（150 mm× 2.00 mm，3 μm）；柱溫：35℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。流動相：A為10 mmol/L乙酸銨以乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.0，B為乙腈。按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1　梯度洗脫程序

2.2質(zhì)譜分析條件

電噴霧離子源（ESI）：正離子模式（ESI+）。掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測。掃描范圍：50～ 600 Da。氣簾氣壓力：25 Pa。碰撞氣密度：中。電離噴霧電壓：5 500 V。離子源溫度：500℃。霧化氣壓力：55 Pa。輔助氣壓力：50 Pa。界面加熱狀態(tài)：開啟。離子對選擇見表2。

2.3對照品溶液的配制

取酚酞、鹽酸西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明對照品各約10 mg，精密稱定，以甲醇制成每1 mL中各含酚酞、西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明1 mg的溶液作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備溶液 1 mL，以50%甲醇，制成各含200 ng/mL的溶液，作為對照品使用液。對照品使用液以50%甲醇等比稀釋，可得到各含 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

表2　質(zhì)譜分析

2.4供試品溶液的配制

將8批分別為丸劑、片劑、膠囊劑（取內(nèi)容物）的中藥制劑樣品及12批分別為膠囊（取內(nèi)容物）、片、茶的保健食品樣品研細(xì)，各取約 0.50 g，精密稱定，置 100 mL量瓶中，加入甲醇約 80 mL，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）15 min，放冷至室溫，再加甲醇至刻度定容，搖勻，以10 000 r/min離心10 min后，取上清液以 50%甲醇溶液稀釋10～ 100倍，經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液測定。

2.5對照品（1 ng/mL）定量離子對提取質(zhì)譜圖

見圖1～4。

圖1　酚酞（1 ng/mL）離子對（319.1/225.1）提取質(zhì)譜

圖2　西布曲明（1 ng/mL）離子對（280.2/139.0）提取質(zhì)譜

圖3　N-單去甲基西布曲明（1 ng/mL）離子對（266.1/125.3）提取質(zhì)譜

圖4　N，N-雙去甲基西布曲明（1 ng/mL）離子對（252.2/125.0）提取質(zhì)譜

2.6定性確認(rèn)

采用保留時間與對照品相一致，且定性與定量離子對相對離子豐度比應(yīng)滿足表3要求，判為檢出。

表3　定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差?。?）

2.7線性關(guān)系及檢出限、定量限考察

采用“2.1”，“2.2”項下的質(zhì)譜條件，以“2.3”項下的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣檢測。以檢測所得峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合。以定性離子對和定量離子對提取的質(zhì)譜圖信噪比均大于3時的濃度（ng/mL）為檢出限。以定性離子對提取的質(zhì)譜圖信噪比大于3，定量離子對提取的質(zhì)譜圖信噪比大于10時的濃度（ng/mL）為定量限。以在一定濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)大于0.99，為線性范圍。結(jié)果見表5。

2.8精密度試驗

選用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中各成分濃度為10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，以提取的定量離子對質(zhì)譜圖峰面積計算。結(jié)果見表6。

2.9穩(wěn)定性試驗

選用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中各成分濃度為10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在0，1，2，4，8，12，24小時分別進(jìn)樣，以提取的定量離子對質(zhì)譜圖峰面積計算。結(jié)果見表7。

表4　對照品試驗結(jié)果

表5　線性關(guān)系及檢出限、定量限考察結(jié)果

表6　精密度試驗結(jié)果

表7　穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.10回收率試驗

取中藥制劑陰性樣品：丸劑（同仁堂輕身消胖丸）、片劑（靚爾娜輕身減肥片）、膠囊劑（體美減肥膠囊）各1批，取保健食品陰性樣品：茶（碧生源減肥茶）、片（康乃馨殼聚糖左旋肉堿荷葉片）、膠囊（輕身樂減肥膠囊）各1批，按“2.4”項下平行稱樣各 3份，分別加入0.05，0.5，5 mL每 1 mL中各含1 mg的對照品儲備液，置100 mL量瓶中，加入甲醇約80 mL，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）15 min，放冷至室溫，再加甲醇至刻度定容，搖勻，以10 000 r/min離心10 min后，取上清液，以50%甲醇溶液稀釋100倍后，經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液測定。3份平行樣最終加標(biāo)濃度分別為5，50，100 ng/mL。以5次平行測定結(jié)果的均值與加標(biāo)濃度相比較，回收率見表8～9。

結(jié)果不同劑型各組分高、中、低三個濃度的回收率均在94.2%～ 101.5%之間。

2.11樣品測定結(jié)果

檢測了8批次中藥制劑及13批次保健食品，結(jié)果20批次為陰性，1批次為陽性。鄭氏膳食素（規(guī)格：250 mg/粒，批號：20141010）檢出含西布曲明20 mg/粒。

表8　中藥制劑中加樣回收試驗結(jié)果

表9　保健食品中加樣回收試驗結(jié)果

3討論

3.1流動相的選擇

試用了醋酸鹽緩沖液-甲醇及醋酸鹽緩沖液-乙腈系統(tǒng)，證實以醋酸鹽緩沖液-乙腈系統(tǒng)離子化效率高，離子強(qiáng)度大，檢測靈敏度高。為提高檢測限，采用梯度洗脫的方式。比較了不同pH值的流動相，結(jié)果在pH值為4.0時各成分分離較好。

3.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)試驗結(jié)果，選用靈敏度高的一種方法。選用靈敏度最高的一組離子對作為定量離子對，再選擇靈敏度次高的一組離子對作為定性離子對。

3.3與現(xiàn)行法規(guī)方法的比較

現(xiàn)行法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)［1］所列的“高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法”采用保留時間、一級質(zhì)譜圖、二級質(zhì)譜圖相一致，作為陽性結(jié)果。而要得到特征的二級質(zhì)譜圖需一定的樣品濃度，經(jīng)試驗需達(dá)到500 ng/mL以上。由于質(zhì)譜的高靈敏度極易污染的特性，進(jìn)樣前樣品需經(jīng)凈化處理并以較大倍數(shù)稀釋，不利于檢出。采用本法，色譜條件較優(yōu)，各成分能基線分離，靈敏度高，0.2 ng/mL即能檢出，0.5 ng/mL即能定量。且酚酞、西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明是日常工作中經(jīng)常需要檢測的參數(shù)。因此本法為簡便，快速，準(zhǔn)確，靈敏度高，專屬性好，且能高通量操作的實用方法。

3.4與文獻(xiàn)方法的比較

文獻(xiàn)［2-3］均只建立了定性的方法，而沒有定量的方法。文獻(xiàn)［4］雖然建立了定量的方法，但還有不完善之處。①文獻(xiàn)［4］中色譜洗脫采用高乙腈強(qiáng)洗脫，色譜過程僅為5 min，所有的檢出化學(xué)成分均在3 min左右出峰，也就是在此時間之后所有的化學(xué)成分均流出，幾乎無保留，沒有充分利用到液相色譜的分離功能來分析化學(xué)物質(zhì)；而本文采用較好的梯度洗脫，保留時間合理，化學(xué)物質(zhì)分離充分，較好地發(fā)揮了液質(zhì)聯(lián)用中液相色譜的分離特點與質(zhì)譜檢測器高靈敏度與選擇性的強(qiáng)強(qiáng)結(jié)合，結(jié)果理想。②文獻(xiàn)［4］中采用濃度范圍0.04～ 40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液來考察線性關(guān)系及檢出限、定量限，采用濃度10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液作精密度、穩(wěn)定性考察，進(jìn)樣濃度偏高；質(zhì)譜檢測器是高靈敏度檢測器，進(jìn)樣濃度偏高會造成過飽和與殘留影響，通常采樣濃度為 ng/mL；本文采用0.1～ 100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以10.0 ng/mL的濃度進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性試驗，則較為合理。

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Determination of Four Components Illegally Mixed into Traditional Chinese Medicines and Healthy Foods for Antiobesity by UPLC-MS/MS

Tu Fenglian1，Wang Yuanfu2（1 Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjian District，Jiangxi Nanchang 330100，China；2 Nanchang Institute for Food and Drug Control，330038）

Objective：To develop a UPLC-MS/MS method for determination offour components（phenolphthalein，sibutratmine，N-Monodesmethylsibutramine and N，N-Didesmethylsibutramine）illegally mixed into traditional Chinese medicines and healthy foods for antiobesity.Methods：Phenomenex Luna C18（2）100A column （150 mm×2.00 mm，3 μm）was used at a column temperature of 35℃，serving 10 mmol/L ammonium acetate（pH 4.0）-acetonitrile as a mobile phase.Gradient elution was adopted at a flow rate of 0.2 mL/min.Signals were collected by optimized MS/MS method.Results：The detection limit of this method was 0.1～ 0.2 ng/mL，while the quantitative detection limit was 0.3～ 0.5 g/mL，and the linear range was the quantitative detection limit ～100 ng/mL.All the correlation coefficients within the linear range was more than 0.99，and the average spike recovery was 94.2% ～ 101.5%.Conclusion：This method is simple，rapid，accurate，and of high sensitivity and high specificity，which may be used for the rapid determination of illegal additives in the traditional Chinese medicines and healthy foods for antiobesity.

UPLC-MS/MS；Phenolphthalein；Sibutratmine；N-Monodesmethylsibutramine；N，N-Didesmethylsibutramine；Illegal Additives

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.06.005

涂鳳蓮，女，主管藥師。研究方向：臨床藥學(xué)、醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：wanngels@sina.com

汪元符，男，主管藥師。研究方向：中藥理論、藥物檢測及食品安全。通訊作者E-mail：wanngel@126.com

2016-03-08）