蠶絲力學(xué)性能的研究進(jìn)展

鄒邦興， 肖文福， 董思材， 張友洪， 周安蓮， 肖金樹， 郭俊英

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)研究所， 四川 南充 637000)

家蠶是鱗翅目昆蟲的代表，也是主要的經(jīng)濟(jì)昆蟲之一，同時(shí)也是用作功能基因分析的重要鱗翅目模式昆蟲，在我國已有數(shù)千年的馴養(yǎng)歷史，傳統(tǒng)上以養(yǎng)蠶繅絲織綢為主要用途。因其蠶絲具有輕盈、光滑、柔美的特點(diǎn)為其贏得了“纖維皇后”的美譽(yù)。然而在蠶絲制品的開發(fā)研究中，蠶絲的機(jī)械性能嚴(yán)重限制了蠶絲制品的高端開發(fā)與應(yīng)用，與蜘蛛絲相比，蠶絲的拉伸強(qiáng)度、韌性性能較差，主要表現(xiàn)在蠶絲易斷、韌性不夠等。為了克服這一缺陷，廣大學(xué)者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行了蠶絲機(jī)械性能研究，筆者就目前基于基因編輯在蠶絲力學(xué)性能上的研究及進(jìn)展進(jìn)行概述，并對(duì)存在的問題和發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行討論。

當(dāng)前蠶桑行業(yè)每況愈下，傳統(tǒng)的栽桑養(yǎng)蠶繅絲織綢模式已不能滿足行業(yè)發(fā)展需求，為拓展蠶桑行業(yè)發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者利用蠶絲的生物學(xué)特性，開發(fā)蠶絲新功能、新用途，進(jìn)而促進(jìn)蠶業(yè)繁榮發(fā)展。然而蠶絲作為紡織材料在應(yīng)用方面存在斷裂強(qiáng)度低、韌性弱等力學(xué)性能方面的不足，因此嚴(yán)重限制了蠶絲的高端應(yīng)用和開發(fā)。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)成功將控制蜘蛛絲的基因?qū)爰倚Q，并獲得了一系列機(jī)械性能強(qiáng)于傳統(tǒng)蠶絲的轉(zhuǎn)基因素材。但到目前為止，各研究機(jī)構(gòu)所獲得的成果僅限于試驗(yàn)階段，生產(chǎn)上仍沒有力學(xué)性能得到改良的蠶品種，蠶絲用途拓展仍處原地。因此，總結(jié)了近10年來蠶絲改良的研究方法及進(jìn)展，為在今后蠶絲改良方面的研究提供借鑒與參考。

1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展

基因組編輯(Genome Editing)技術(shù)作為生命科學(xué)技術(shù)史發(fā)展中的一項(xiàng)突破性技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了針對(duì)基因的精準(zhǔn)修改，包括基因的插入、缺失或替換等[1]。利用基因組編輯技術(shù)可以在基因功能分析和疾病基因治療研究方面具有廣闊應(yīng)用前景。目前實(shí)驗(yàn)室所用的基因編輯技術(shù)主要有第一代基因編輯工具鋅指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)、第二代基因編輯工具類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)及第三代基因編輯工具成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列CRISPR (clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)相關(guān)核酸酶Cas9(crisprassociatednuclease Cas9)系統(tǒng)(即CRISPR/Cas9 系統(tǒng))的3種不同基因編輯工具。其中以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術(shù)目前在全球各大實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用。

1.1 第一代基因組編輯技術(shù)

鋅指核酸酶是一種由鋅指模塊和Fokl核酸酶結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白[2-3]。鋅指是普遍存在于轉(zhuǎn)錄因子中小的天然DNA結(jié)構(gòu)域，DNA識(shí)別域是由一系列Cys2-His2鋅指蛋白(zinc-fingers)串聯(lián)組成(一般3～4個(gè))，1個(gè)鋅指可以特異識(shí)別3個(gè)堿基；鋅指核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)是Folk需要形成1個(gè)二聚體才具有切割DNA雙鏈的酶活性[4]。自從鋅指核酸酶首次在果蠅中成功敲除yellow基因后，先后在斑馬魚、小鼠、豬、家蠶、擬南芥[5-9]等生物體上進(jìn)行基因修飾，但是編輯效率較低，而且耗時(shí)較長，成本較高。

1.2 第二代基因編輯技術(shù)

類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶是來源于植物病原菌黃單胞桿菌的分泌蛋白，最先由Adam J.Bogdanove團(tuán)隊(duì)和Ulla Bonas[10-11]團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)其可以和DNA作用。其后的研究解析了TALEN的DNA結(jié)合域的重復(fù)可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidues，RVDs)和靶DNA的核苷酸之間有某種一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。在發(fā)現(xiàn)了TALE的密碼后，研究者將TALE蛋白與核酸酶組合形成了第二代基因編輯工具TALENS。該技術(shù)出現(xiàn)后，很快在斑馬魚、小鼠、果蠅、昆蟲[12-15]等動(dòng)物上成功進(jìn)行基因修飾。和ZFN相比，TALEN從原來識(shí)別3個(gè)堿基變成了識(shí)別1個(gè)堿基，增加了基因編輯的難度，但是后者在設(shè)計(jì)上比前者簡單，不需耗費(fèi)大量時(shí)間，在靶位點(diǎn)識(shí)別上，TALEN的選擇范圍更廣，特異能力更強(qiáng)，靶效率更高。但是這2種方法都是用蛋白質(zhì)識(shí)別目的基因的核酸序列，因此在使用時(shí)工作量較大，且編輯效率不高。

1.3 第三代基因編輯技術(shù)

CRISPR/Cas最先由NAKATA等[16]在大腸桿菌的iap基因下游發(fā)現(xiàn)的1個(gè)成簇的29 bp重復(fù)序列，隨后在古細(xì)菌中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，這些重復(fù)序列后來被稱為間隔序列(spacer)DNA的非重復(fù)短序列。2002年JANSEN和MOJICA將這類短重復(fù)序列統(tǒng)稱為CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)。CRISPR在不同物種間其位點(diǎn)數(shù)量和包含的重復(fù)序列存在差異[17]。后來，研究者發(fā)現(xiàn)與CRISPR相關(guān)的4個(gè)蛋白基因(Cas)[18]，此后在廣大科學(xué)家[19-25]的努力下，先后在葡萄球菌、嗜熱鏈球菌的CRISPR上進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Cas9蛋白被gRNA引導(dǎo)切割DNA，這些重要發(fā)現(xiàn)，為深入研究CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

與ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組靶向編輯在原理上是全新的，其靶位點(diǎn)識(shí)別由與靶標(biāo)序列互補(bǔ)的短RNA決定。目前最為常用的CRISPR/Cas系統(tǒng)是僅在細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)，其工作原理為將CRISPR元件轉(zhuǎn)錄生成的CRISPR RNA (crRNA ) 和transactivating-CRISPR RNA (tracrRNA) 這2個(gè)非編碼RNA改造成一種單導(dǎo)向RNA( single-guideRNA，sgRNA)，sgRNA能夠引導(dǎo)Cas9 蛋白結(jié)合并切割靶位點(diǎn)DNA序列[26-27]。

2 基因編輯在家蠶中的應(yīng)用

隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，家蠶作為模式生物，具有飼養(yǎng)周期短、各階段形態(tài)特征明顯的優(yōu)點(diǎn)被國內(nèi)外廣大學(xué)者作為基因編輯技術(shù)應(yīng)用的首選。自夏慶友[28-29]將家蠶全基因組測序及精細(xì)圖譜構(gòu)建以來，蠶絲生物反應(yīng)器的開發(fā)迎來井噴時(shí)代，如蠶絲合成與分泌機(jī)制研究[30]、變態(tài)發(fā)育的激素調(diào)控研究[31]、性別調(diào)控研究[32]以及轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物反應(yīng)器開發(fā)等領(lǐng)域[33-34]。與此同時(shí)MA[35]和WANG[36]分別利用 TALEN和CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組靶向編輯技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)BmBLOS2 基因的定點(diǎn)敲除，并獲得了陽性純合突變體家蠶。隨后，來自日本國立農(nóng)業(yè)生物資源研究所、日本信州大學(xué)纖維學(xué)部以及浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院的研究人員，相繼利用基于TALEN或CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組靶向編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)家蠶Bm-re[37]、BmFibH[34]和Bm-ok[38]等內(nèi)源基因的定點(diǎn)敲除。WANG[39]和TAKASU等[40]分別用Golden Gate 組裝體系建立了一套適用于家蠶的TALE 核苷酸骨架組裝的方法，LIU等[41]將sgRNA和Cas9核酸酶表達(dá)載體質(zhì)?；旌蠈?dǎo)入體外培養(yǎng)家蠶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了對(duì)家蠶細(xì)胞基因組靶位點(diǎn)的精確定點(diǎn)敲除與染色體結(jié)構(gòu)變異操作，并證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有在家蠶細(xì)胞和胚胎中介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)多基因敲除的潛力。自此，分別由ZFN，TALEN和CRISPPR/Cas9系統(tǒng)這3類介導(dǎo)的基因組靶向編輯技術(shù)均已經(jīng)在家蠶中成功建立并取得應(yīng)用。

近年來隨著蠶業(yè)發(fā)展中面臨的問題：土地成本增加、青壯年勞力外出、產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、行業(yè)不穩(wěn)定等因素制約，傳統(tǒng)蠶桑經(jīng)營模式已不能滿足產(chǎn)業(yè)發(fā)展。為了產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)，將功能單一化的蠶桑業(yè)轉(zhuǎn)為多元化發(fā)展，桑果綜合利用、桑葉茶開發(fā)、蛋白飼料桑、蠶蛹粉、蠶絲用途研發(fā)等蠶桑副產(chǎn)業(yè)應(yīng)運(yùn)而生，其中圍繞蠶絲新用途的研發(fā)較為熱門，根據(jù)其生物學(xué)特性，轉(zhuǎn)基因蠶絲不斷在醫(yī)學(xué)、美容、軍工上取得進(jìn)展，研究者們成功研制了一批轉(zhuǎn)基因生物學(xué)繭絲材料，主要成果有：TAN[42]等應(yīng)用轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)核酸酶介導(dǎo)的同源定向修復(fù)，用蜘蛛Nephila clavipes中主要的壺腹蛛絲蛋白-1基因(MaSp1)取代家蠶絲素重鏈基因(FibH)，成功用1.6 kb的MaSp1基因替換了家蠶絲素重鏈中16 kb的內(nèi)源FibH基因，構(gòu)建了表達(dá)蜘蛛絲纖維的轉(zhuǎn)基因蠶，并在繭殼中實(shí)現(xiàn)了高達(dá)35.2%的嵌合MaSp1蛋白量(圖1)。WANG等[43]利用家蠶絲腺多基因生物反應(yīng)器系統(tǒng)成功將人堿性成纖維細(xì)胞生長因子和人轉(zhuǎn)移細(xì)胞生長因子2種重組蛋白同時(shí)表達(dá)至蠶絲纖維中，建立獲得可以穩(wěn)定遺傳的新型蠶絲家蠶素材品系，以實(shí)現(xiàn)雙生長因子新型蠶絲的高效低成本生產(chǎn)，對(duì)拓展蠶絲在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用具有重要促進(jìn)作用。ZHANG等[44]利用蠶絲具有和人類皮膚高度親和的特點(diǎn)，開發(fā)了一種絲素蛋白膜，有效地減少了平均傷口愈合時(shí)間，具有更好的皮膚再生，該研究提供了系統(tǒng)的臨床前和臨床證據(jù)，證明絲素蛋白膜促進(jìn)傷口愈合，從而為其在臨床中應(yīng)用皮膚修復(fù)和再生奠定了基礎(chǔ)。YERRA[45]研究表明飼喂亞精胺(Spd)可顯著增加纖維長度，進(jìn)而影響蠶繭的結(jié)構(gòu)，機(jī)械和分子水平的絲質(zhì)量，這可以在絲綢生物材料生產(chǎn)中被利用。與此相應(yīng)CHENG等[46]通過在家蠶日糧中添加不同物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)酪氨酸和絲素蛋白氨基酸顯著增加絲纖維中的鉀含量，誘導(dǎo)α-螺旋和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生更高的結(jié)晶度和更好的機(jī)械性能(圖2)。該發(fā)現(xiàn)提供了綠色且有效的方法，用于大規(guī)模生產(chǎn)具有高結(jié)晶度的機(jī)械增強(qiáng)的絲纖維。WANG等[47-48]研究表明，利用轉(zhuǎn)基因蠶產(chǎn)生的絲具有良好的生物相容性、生物降解性和自組裝能力，為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供良好材料。 KAWABATA 等[49]開發(fā)絲-彈性蛋白聚合物，這種新型材料具有從液體到凝膠的能力，可以應(yīng)用于難用水溶液處理的各種傷口。筆者將羊毛角蛋白基因轉(zhuǎn)入到家蠶絲腺中，獲得陽性個(gè)體，但經(jīng)力學(xué)性能檢測，其性能并未提高，且比對(duì)照低，其原因可能是外源基因難在絲腺內(nèi)完整表達(dá)。這些研究均為蠶絲的利用提供技術(shù)支撐方向，為今后蠶業(yè)的發(fā)展提供選擇。

圖1 轉(zhuǎn)蜘蛛MaSp1基因蠶絲腺對(duì)比

Fig.1 Comparison of silk glands in transgenic spiderMaSp1 gene

圖2 蠶絲天然結(jié)構(gòu)的改變

3 展望

我國是傳統(tǒng)的栽桑養(yǎng)蠶大國，抗戰(zhàn)時(shí)期，我國靠著絲綢織物出口創(chuàng)外匯給軍隊(duì)提供補(bǔ)給。改革開放初期，絲綢每年占據(jù)我國外匯的1/3。而隨著經(jīng)濟(jì)大發(fā)展，蠶桑行業(yè)采取“東桑西移”的發(fā)展戰(zhàn)略，加之近年來農(nóng)村勞力大量外出，產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整，蠶桑發(fā)展面臨嚴(yán)重挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的栽桑養(yǎng)蠶繅絲織綢模式已不能滿足當(dāng)前行業(yè)發(fā)展的需求，蠶桑行業(yè)要繼續(xù)發(fā)展，必須要開發(fā)其他用途，蠶絲作為天然纖維，具有很好的皮膚親和能力，因此可以開發(fā)成手術(shù)縫合線；絲綢織物具有輕盈特點(diǎn)，可以制作成防彈衣和宇航服。這些都能滿足蠶絲行業(yè)的繼續(xù)發(fā)展，而目前最急需解決的是蠶絲力學(xué)性能的改良，因?yàn)楫?dāng)前生產(chǎn)上使用的品種均不能完全滿足上述蠶絲特殊用途。

國內(nèi)外研究者紛紛通過轉(zhuǎn)基因手段、外源添食方法及理化原理進(jìn)行蠶絲的生物學(xué)性狀改良，以提高蠶絲的力學(xué)性能，并取得一系列研究成果，但到目前為止仍然沒獲得可以在生產(chǎn)上應(yīng)用的改良品種，原因主要有轉(zhuǎn)基因繭絲素材遺傳穩(wěn)定性不夠，脫靶效率增加轉(zhuǎn)基因材料獲取的難度，外源基因與宿主基因存在排斥，導(dǎo)致許多功能性狀好的基因無法植入家蠶體內(nèi)，外源基因在家蠶體內(nèi)的表達(dá)量不足；實(shí)驗(yàn)室需要從事基礎(chǔ)研究，而許多基礎(chǔ)研究在轉(zhuǎn)變成成果的過程中又與國家政策存在矛盾，主要體現(xiàn)在公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因生物安全問題存在擔(dān)憂，因此農(nóng)業(yè)部將轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物申報(bào)列為三大安全性評(píng)估內(nèi)容之一，加大對(duì)轉(zhuǎn)基因品種的制約。這些客觀因素均制約轉(zhuǎn)基因材料走出實(shí)驗(yàn)室，同時(shí)也影響科研人員從事更加深入基礎(chǔ)研究的信念，如何處理好轉(zhuǎn)基因蠶絲材料的研發(fā)和應(yīng)用將是今后蠶業(yè)科研人員長期面臨的問題。針對(duì)這種現(xiàn)狀，筆者認(rèn)為今后的研究應(yīng)當(dāng)圍繞市場需求和產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢(shì)深入開展，在符合轉(zhuǎn)基因品種安全的條件下加大對(duì)家蠶繭絲的基礎(chǔ)研發(fā)力度。同時(shí)各科研單位之間應(yīng)加強(qiáng)溝通與合作，開展學(xué)術(shù)交流，取長補(bǔ)短，避免重復(fù)研究。