鐵皮石斛葉總黃酮泡騰顆粒劑的制備與抗氧化活性研究

林雪媛，王宇軒，彭意，劉桂燕，謝俊朗，鐘桂冬，羅惠玲，張澤蓉，王瑞彬，李艷萍

(1．佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院＜醫(yī)藥工程學(xué)院＞，廣東 佛山528000;2．廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院＜廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院＞，廣東佛山528300)

鐵皮石斛是藥用石斛中的上品，具有強(qiáng)陰益精、厚腸胃、補(bǔ)內(nèi)絕不足、輕身延年等功效，自古有“藥中黃金”的美譽(yù)。鐵皮石斛曾是稀缺的野生藥材資源，現(xiàn)在通過生物技術(shù)已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模種植。2018年5月，鐵皮石斛正式進(jìn)入《藥食同源植物名錄》。同年6月，鐵皮石斛葉、花成為“新食品原料”。

鐵皮石斛的種植過程復(fù)雜，需要投入大量的人員、技術(shù)和資金［1］?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定鐵皮石斛以莖部入藥，采摘時(shí)占鮮條產(chǎn)量約50%的葉子常被丟棄，造成藥材資源的嚴(yán)重浪費(fèi)，也影響著產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。因此，對(duì)鐵皮石斛葉進(jìn)行有效開發(fā)利用具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛葉中黃酮含量豐富［2-3］，并且具有較好的抗氧化能力，若以黃酮碳苷含量及抗氧化活性為指標(biāo)，鐵皮石斛葉和花代替莖入藥有一定可能［4］。黃酮類物質(zhì)是一種具有多種活性的天然成分，在抗心血管疾病和抗炎等方面有較多的應(yīng)用。本論文將鐵皮石斛葉總黃酮提取物制備成泡騰顆粒劑，并測(cè)定其總黃酮的含量以及抗氧化能力。其中泡騰顆粒劑是一種以弱堿和有機(jī)酸為崩解劑的速釋劑型，投入水中會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，迅速溶解后在水中均勻分布，具有吸收快、生物利用度高、便于運(yùn)輸攜帶、口感好等特點(diǎn)［5］。

目前市場(chǎng)上鐵皮石斛的產(chǎn)品主要以莖部為主，其葉的產(chǎn)品很少，本論文的研究將為鐵皮石斛葉的開發(fā)利用提供一個(gè)參考方向。

1 材料與方法

1．1 儀器 DMF-4B手提式高速中藥粉碎機(jī)(浙江溫嶺市銘大藥材機(jī)械設(shè)備有限公司);JJ300型精密電子天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠);10目、18目與80目分樣篩(上海宜昌儀器紗篩廠);AS5150B型超聲波清洗機(jī)(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);UV1600PC型紫外-可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司);YE3K165875移液槍(上海求精生化試劑儀器有限公司);RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1．2 試劑 鐵皮石斛葉(廣東國(guó)方醫(yī)藥有限公司);碳酸氫鈉(北京凌云建材化工有限公司);檸檬酸(廣州市海珠區(qū)化學(xué)試劑廠);藥用乳糖(上海華茂藥業(yè)有限公司);聚乙二醇6000(PEG6000，廣州市醫(yī)藥公司);乙醇(廣東光華科技股份有限公司);亞硝酸鈉(廣州試劑廠);DPPH(Sigma公司);Trolox(阿拉丁試劑公司);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200707);氫氧化鈉(廣州試劑廠);硝酸鋁(廣州試劑廠);石油醚(60～90℃，廣州試劑廠)。

1．3 方法

1．3．1 鐵皮石斛葉中總黃酮干粉的制備 將干燥至恒重的鐵皮石斛葉搗碎研磨成粉，用濾紙包好，置索氏提取器中，加入石油醚，在80℃水浴中回流脫脂。將脫脂后的粉末置蒸發(fā)皿中揮干石油醚，然后置250mL具塞錐形瓶中，加入80%的乙醇進(jìn)行超聲提取，每次提取時(shí)間為50min，共提取3次并合并提取液。55℃下減壓旋蒸，得到鐵皮石斛葉總黃酮浸膏。將所得的浸膏冷凍干燥后即得干粉。

1．3．2 泡騰顆粒劑輔料處方的優(yōu)化 采取L9(34)正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化鐵皮石斛葉泡騰顆粒劑的處方，鐵皮石斛葉總黃酮提取物干粉質(zhì)量比恒定為6%。以粒度、溶化時(shí)間［9］為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察乳糖的用量、檸檬酸與碳酸氫鈉的配比、PEG6000的用量對(duì)泡騰顆粒劑影響。正交試驗(yàn)因素水平表見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1．3．3 泡騰顆粒劑的制備 取乳糖、鐵皮石斛葉總黃酮提取物干粉分別粉碎，過80目篩，各分成2份，備用。

制備堿性顆粒：取PEG6000，加熱融化后，加入碳酸氫鈉，混勻，冷卻，粉碎后過80目篩，備用;取鐵皮石斛葉總黃酮提取物干粉于研缽中，按等量遞加法加入乳糖和PEG6000包裹的碳酸氫鈉混勻，加入適量70%乙醇混合制成軟材，過18目篩擠壓制粒，置60℃烘箱內(nèi)干燥(約1h)，過18目篩整粒，再過四號(hào)篩(65目)篩去細(xì)粉。

制備酸性顆粒：取鐵皮石斛葉總黃酮提取物干粉于研缽中，按等量遞加法加入乳糖和檸檬酸混勻，加入適量70%乙醇混合制成軟材，過18目篩擠壓制粒，置60℃烘箱內(nèi)干燥(約1h)，過18目篩整粒，再過四號(hào)篩(65目)篩去細(xì)粉。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

將上述兩種顆?；旌暇鶆颍纯?。

1．3．4 泡騰顆粒劑的檢查 顆粒性狀檢查：取泡騰顆粒3份，每份10g，進(jìn)行性狀檢查。

粒度的測(cè)定：取泡騰顆粒3份，每份10g，分別稱定重量，依次通過一號(hào)篩和五號(hào)篩，保持水平狀態(tài)過篩，左右往返，邊篩動(dòng)邊拍打3min。取不能通過一號(hào)篩和能通過五號(hào)篩的顆粒及粉末，稱定重量，計(jì)算其所占比例(%)。

泡騰時(shí)間的測(cè)定：取泡騰顆粒3份，每份10g，分別移至盛有200mL水(溫度為25℃)的燒杯中，觀察并記錄泡騰時(shí)間。

休止角的測(cè)定：采取固定漏斗法［10］，將3只漏斗串聯(lián)并固定于水平放置的坐標(biāo)紙上，漏斗下口距紙高度為H，小心地將顆粒沿漏斗壁倒入最上的漏斗口中，直到錐體尖端觸到漏斗下口為止，測(cè)定錐體半徑R，計(jì)算休止角，重復(fù)3次。休止角的測(cè)定公式為：θ=arctan()，其中 θ為休止角，R為底盤半徑。

水分含量測(cè)定：取泡騰顆粒3份，每份5g，平鋪于干燥的稱量瓶中，厚度不超過10mm，精密稱定，開啟瓶蓋在鼓風(fēng)干燥箱中100℃干燥5h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，放冷30min，精密稱定，再在上述溫度干燥1h，放冷，稱重，稱至兩次稱重不超過5 mg，計(jì)算水分含量，重復(fù)3次。

1．3．5 泡騰顆粒劑中總黃酮的含量測(cè)定［11］標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取蘆丁對(duì)照品0．0100g，溶解后置于50mL容量瓶，定容，配制成0．2mg·mL-1的蘆丁對(duì)照品溶液。精密量取蘆丁對(duì)照品溶液各0．00、1．00、2．00、3．00、4．00、5．00mL，分別置于 10mL 容量瓶中，各加80%乙醇溶液補(bǔ)足5mL。分別精密加入5%亞硝酸鈉溶液0．3mL，搖勻，放置6min。加入10%硝酸鋁溶液0．3mL，搖勻，再放置6min。加入1mol·L-1氫氧化鈉溶液4mL，最后用80%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min。以第一瓶(0．00mL)作空白，用紫外-可見分光光度計(jì)在510nm處測(cè)其吸收度，作A-C標(biāo)準(zhǔn)曲線(同時(shí)計(jì)算其回歸方程)。

樣品含量測(cè)定：精密稱取泡騰顆粒3份，每份1．0g，溶解后置于25mL容量瓶中，定容，得到供試品溶液。精密吸取3份供試品溶液各5mL，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法進(jìn)行含量測(cè)定，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算各樣品中黃酮的含量。

1．3．6 泡騰顆粒劑抗氧化能力的測(cè)定［1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH法)］［12-13］對(duì)照品 Trolox溶液IC50的測(cè)定：精密稱取 Trolox0．0010g，溶解后置于50mL容量瓶，定容，配制成80μmol·L-1的溶液，并將其稀釋成 60、40、20 和 10 μmol·L-1。取上述Trolox溶液各2mL，分別精密加入2mL的DPPH溶液，充分混合，室溫避光放置50min。用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定在517nm處的吸光度，并計(jì)算清除率。同時(shí)，取2mL的80%乙醇與2mL的DPPH溶液混合后作為陰性對(duì)照，空白為80%乙醇。

樣品溶液IC50的測(cè)定：精密稱取泡騰顆粒3份，每份1．0g，溶解后置于25mL容量瓶中，用80%乙醇定容，然后將3份溶液分別依次稀釋成1、2、3、4、5mg·mL-1的溶液。精密吸取上述溶液各2mL，分別精密加入2mL的DPPH溶液，按照對(duì)照品的測(cè)定方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算樣品溶液的清除率并作清除率-濃度曲線。

2 結(jié)果與分析

2．1 泡騰顆粒劑輔料處方優(yōu)化結(jié)果 正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，粒度方差分析見表3，溶化時(shí)間方差分析見表4。由表3可知，對(duì)于粒度因素A、B、C的影響均無(wú)顯著性。由表4可知，對(duì)于泡騰時(shí)間，因素A、C的影響較大，它們對(duì)應(yīng)的極差也較大，為主要影響因素，B的影響較小。各因素主次順序?yàn)椋篈＞C＞B。結(jié)合表4中各因素極差分析，最終確定最佳輔料處方為A1B2C2，即乳糖含量為40%，檸檬酸與碳酸氫鈉的配比為 1．3∶1，PEG6000 含量為 9%。

依據(jù)此配方制備鐵皮石斛葉總黃酮進(jìn)行泡騰顆粒劑(見“1．3．4”項(xiàng)下)并對(duì)其進(jìn)行黃酮含量與抗氧化活性研究。

2．2 泡騰顆粒劑檢查結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)制備的泡騰顆粒劑顆粒均勻，大小一致，顏色淡黃，氣味芳香，不合格的顆粒比例平均值為1．88%(見表5)，從開始泡騰到溶化結(jié)束時(shí)間平均值為138s(見表6)，水分含量為5．45%(見表7)，結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》2015年版(四部)的相關(guān)規(guī)定。另外，休止角平均值為29．70°(見表8)，說(shuō)明其流動(dòng)性好，可以滿足生產(chǎn)過程中流動(dòng)性的要求。

表3 粒度方差分析表

表4 溶化時(shí)間方差分析表

表5 粒度檢查結(jié)果

表6 溶化性檢查結(jié)果

表7 水分測(cè)定結(jié)果

表8 休止角測(cè)定結(jié)果

2．3 泡騰顆粒劑中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果 所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1所示，其方程為：Y=10．395X+0．0015(R2=0．9994)，表明在 0．0118 ～ 0．0590 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。根據(jù)此方程計(jì)算得到泡騰顆粒劑中總黃酮的含量平均值為(1．29±0．08)mg·g-1。

圖1 蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2．4 泡騰顆粒劑抗氧化能力測(cè)定結(jié)果 DPPH法是常用的抗氧化能力評(píng)價(jià)方法。陽(yáng)性對(duì)照Trolox的清除率 -濃度曲線見圖 2，其 IC50為 22．54 μmol·L-1。泡騰顆粒劑的清除率-濃度曲線見圖3，其 IC50為(3．77±0．10)mg·mL-1。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)制備的鐵皮石斛葉總黃酮泡騰顆粒劑具有良好的抗氧化能力。

圖2 Trolox的清除率-濃度曲線

圖3 鐵皮石斛泡騰顆粒劑的清除率-濃度曲線

3 討論與結(jié)論

目前市面上鐵皮石斛葉的產(chǎn)品還較少，相關(guān)劑型還有待進(jìn)一步開發(fā)。因此研究開發(fā)鐵皮石斛葉中的黃酮類化合物具有廣闊的前景。本文將葉中的黃酮提取物制備成具有良好抗氧化能力的泡騰顆粒劑，為鐵皮石斛葉資源的開發(fā)與利用提供了一個(gè)可行的方向。

中藥提取物一般容易吸濕，影響制劑的工藝。為減少泡騰顆粒吸濕，選用吸濕性較小的乳糖作為稀釋劑，同時(shí)采用等量遞加法將鐵皮石斛葉提取物干粉與乳糖等輔料混勻。這樣一方面降低了顆粒與主藥的吸濕性，另一方面使主藥分散均勻，保證制劑的均一性。另外，采用PEG6000包裹碳酸氫鈉，并把酸堿顆粒分開制粒，這樣可以有效地隔離了酸源與二氧化碳源，保證制劑的穩(wěn)定。

輔料的選擇與泡騰劑的處理對(duì)泡騰顆粒劑的制備也很重要。輔料要選水溶性強(qiáng)且吸水性弱的，否則泡騰時(shí)間會(huì)不達(dá)標(biāo)且易在包裝袋中膨脹。PEG6000與碳酸氫鈉混合過程中，應(yīng)先將PEG6000充分加熱溶解，然后稍冷片刻再加入研磨后的碳酸氫鈉粉末。否則碳酸氫鈉在高溫下易受熱分解，釋放出二氧化碳，會(huì)影響泡騰效果。