大鼠酒精性肝纖維化模型的建立

潘婷 宰青青 王翠肖

【摘要】目的：建立大鼠酒精性肝纖維化模型，觀察造模過程中大鼠肝組織的變化及建模的可行性。方法：取40只Wistar雄性大鼠，隨機(jī)分為造模組（n=30）和正常對(duì)造組（n=10）。造模組予“60%乙醇-吡唑-玉油”混合液灌胃（1次/天）制備酒精性肝纖維化大鼠模型，正常對(duì)照組予等量生理鹽水灌胃。于造模12、16、24周末分批心臟采血，以測(cè)定肝功能指標(biāo)，后行放血法處死。取出肝組織先稱重再行HE染色法觀察肝組織的病理變化。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，造模組大鼠肝指數(shù)、血清ALT和AST明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在造模12周末呈現(xiàn)輕度酒精性肝纖維化，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)肝纖維化逐步加重，但并未呈現(xiàn)肝硬化的表現(xiàn)。結(jié)論：應(yīng)用“60%乙醇-吡唑-玉米油”混合液灌胃法可成功建立大鼠酒精性肝纖維化模型。

【中圖分類號(hào)】R249【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-6851（2019）06-035-01

酒精性肝纖維化（Alcoholic liver fibrosis，ALF）是因?yàn)樵谝掖?、乙醛的慢性持續(xù)性損傷作用下，肝臟纖維組織大量增生，而基質(zhì)金屬蛋白酶/金屬蛋白酶組織抑制劑調(diào)節(jié)失衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積的結(jié)果[1]，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的提高以及飲酒文化的影響，引發(fā)的ALF患病率越來越多。而ALF是病情逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵點(diǎn)[2-3]，它可阻斷病情向肝硬化的發(fā)展。目前研究酒精性肝纖維動(dòng)化動(dòng)物模型比較多，但想要迅速建立一個(gè)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、穩(wěn)定性強(qiáng)、周期短、成功率高的模型比較困難，本文在前人研究的基礎(chǔ)上[4-6]，對(duì)造模方法稍加改進(jìn)，擬在探討60%乙醇-吡唑-玉米油聯(lián)合造模的可行性。

1 材料

1.1 儀器

ELX800-MV型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）;AO-820手動(dòng)石蠟切片機(jī)（英國(guó)制造）;IX71型倒置顯微鏡（日本Olympms 公司）。

1.2 藥品與試劑

無水乙醇（重慶川東化工集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20160201）;丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測(cè)定試劑盒（南京生物建成有限公司，批號(hào)： 20160911）;天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）測(cè)定試劑盒（南京生物建成有限公司，批號(hào)：20161011）;玉米油（山東魯花集團(tuán)有限公司）;吡唑（上海阿爾丁生化科技股份有限公司）

1.3 動(dòng)物

健康Wistar雄性大鼠40只，體重為180～220g，SPF級(jí)（遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（遼）2015-0001。

2 方法

按照文獻(xiàn)中的方法[4-6]并加以改進(jìn)。將40只雄性Wistar大鼠正常喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為造模組（n=30）和正常對(duì)照組（n=10），造模組每日予60%乙醇、玉米油、吡唑按質(zhì)量比1000：250：3混合成混懸液灌胃，第1周灌胃劑量6mL/kg/d，，第2周灌胃劑量8mL/kg/d，第3周灌胃劑量10mL/kg/d，第四周灌胃劑量12mL/kg/d，以后維持此量直至24周末。同時(shí)正常對(duì)照組予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠正常飲食。在造模12、16、24周末分批禁食、禁飲12h，稱定大鼠體重。用10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉固定后，心臟取血，抽取5～10mL血液，于室溫環(huán)境下擱置30分鐘，離心（3000rpm，15min）取上層血清，待測(cè)血清肝功能指標(biāo)。取出肝組織，精確稱取肝總量并計(jì)算肝指數(shù)。取一部分肝組織用10%中性福爾馬林固定。

2.1 檢測(cè)血清肝功能指標(biāo)按照試劑盒說明書操作，采用微板法測(cè)定血清中ALT和AST的含量。

2.2 計(jì)算肝指數(shù)肝指數(shù)=肝質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100%

2.3 組織病理學(xué)指標(biāo)檢測(cè)各組大鼠肝組織在10%中性福爾馬林固定24h后，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。于電子顯微鏡下觀察肝臟病理學(xué)變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清ALT和AST的活性與正常對(duì)照組比較，各造模組ALT 和AST明顯升高（P<0.01），隨著酒精刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，ALT和AST升高更加顯著。見表1.

3.2 大鼠肝指數(shù)的測(cè)定結(jié)果與正常對(duì)照組比較，各造模組大鼠體重顯著下降（p<0.05或p<0.01），肝指數(shù)明顯升高（p<0.05或p<0.01）。結(jié)果見表2

3.3 肝組織病理學(xué)觀察

各組大鼠行HE染色鏡下可見：正常對(duì)照組見肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核大而圓，有1個(gè)至數(shù)個(gè)核仁，多核細(xì)胞多見，肝板以中央靜脈為中心呈放射狀分布。造模12周見肝細(xì)胞脂肪變性，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，可見竇周有少量纖維組織沉積。造模16周肝細(xì)胞脂肪變性加重，有大量脂滴溢出，肝細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，匯管區(qū)有大量纖維組織沉積。造模24周肝細(xì)胞壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)更加嚴(yán)重，中央靜脈、匯管區(qū)及其匯管周圍有大量纖維組織沉積，部分肝小葉被破壞但未出現(xiàn)酒精性肝硬化的表現(xiàn)。

4 討論

目前關(guān)于酒精性肝纖維化造模的方式有很多，如Liber-Decarli液體食料模型[7]和Liber-Decarli液體食料加輔劑模型[8]等模型，但由于大鼠天生厭酒，加之實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，費(fèi)用高、成功率比較低，已經(jīng)很少采用。目前比較常用的是酒精-吡唑-玉米油混合液灌胃法復(fù)制酒精性肝纖維化模型，該模型操作簡(jiǎn)單、周期短，成模率高。本次實(shí)驗(yàn)中，造模大鼠12周出現(xiàn)了輕度的酒精性肝纖維化，而且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，肝纖維程度逐漸加重，至造模24周匯管區(qū)及匯管周圍出現(xiàn)大量纖維組織沉積，許多肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，但并導(dǎo)致酒精性肝硬化的表現(xiàn)。采用酒精-吡唑-玉米油混合液灌胃法可成功制備酒精酒精性肝纖維化模型。

參考文獻(xiàn)：

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