阿爾茨海默病患者外周血淋巴細胞DNA端粒長度與認知功能的關(guān)系

晏玉奎 孫曉燕 鈕富榮

[摘要] 目的 探討AD患者認知功能障礙及其嚴重程度與淋巴細胞DNA端粒長度的關(guān)系。方法 方便采集2005年1月—2018年4月該院就診的82例AD患者的臨床資料，進行MMSE、CDR及MoCA量表評分，并采集AD患者外周血，RT-PCR法測定DNA端粒長度，Kaplan-Meier法分析AD患者疾病嚴重程度與DNA端粒長度的關(guān)系。結(jié)果 輕中度CDR、MMSE評分患者較重度患者，其生存函數(shù)時間長，模擬DNA端粒長度具差異有統(tǒng)計學意義（Log-Rank=1.82，P=0.006;Log-Rank=1.46，P=0.004），具有輕中度MoCA量表評分的AD患者較重度患者，其生存函數(shù)時間長，模擬DNA端粒長度同樣差異有統(tǒng)計學意義（Log-Rank=1.28，P=0.005）。結(jié)論 AD患者外周血淋巴細胞DNA端粒長度與認知功能具有一定的量變關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] AD患者;DNA端粒長度;認知功能

[中圖分類號] R749.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）04（c）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between cognitive dysfunction and telomere length of lymphocyte DNA in AD patients . Methods The clinical data of 82 AD patients were collected from January 2005 to April 2018. The MMSE， CDR and MoCA scales were scored， the peripheral blood of AD patients were convenient collected， and the length of DNA telomeres was determined by RT-PCR. Kaplan-Meier method was used to analyze the relationship between the severity of disease and DNA telomere length in AD patients. Results Compared with the patients， who had severe CDR and MMSE scores， the patients with mild to moderate MMSE and CDR scores had long survival function time， and simulated DNA telomere length had statistical differences（Log-Rank=1.82， P=0.006; Log-Rank=1.46， P=0.004）. Compared AD patients， who had severe MoCA scale score， the patients with mild to moderate MoCA scale score had long survival function time， and simulated DNA telomere length also had statistical differences （Log-Rank=1.28， P=0.005）. Conclusion There is a quantitative relationship between DNA telomere length of peripheral blood lymphocyte and cognitive function of patients with AD.

[Key words] AD patient; DNA telomere length; Cognitive function

阿爾茨海默?。╝lzheimer disease，AD） 是最常見的癡呆類型，屬于神經(jīng)退行性疾病的一種，其臨床特點是嚴重的認知功能障礙，學習和記憶能力障礙，判斷力、定向力及語言功能的下降等[1]。年齡是AD的高危因素，但兩者之間的關(guān)系仍不清。端粒是細胞老化過程中的關(guān)鍵元件，一旦端?？s短到一定的程度，細胞分裂將會停止，細胞進入衰老狀態(tài)，因此，端粒在人體中充當“分子鐘”的作用，在正常軀體細胞中，端粒隨年齡增長而縮短，并呈線性關(guān)系，此現(xiàn)象已在人類外周血細胞中觀察到，而且近期研究發(fā)現(xiàn)端粒-端粒酶系統(tǒng)的穩(wěn)定與人類的衰老及相關(guān)疾病如AD有密切關(guān)系[2]。然而，對于AD患者認知功能障礙及其嚴重程度與淋巴細胞DNA端粒長度的關(guān)系尚未報道，因此方便選取2005年1月—2018年4月就診于該院癡呆中心的AD患者82例為研究對象，初步分析確診AD患者與外周血淋巴細胞DNA端粒長度的關(guān)系，試圖為揭示該病發(fā)病機制提供一些線索。

1? 對象與方法

1.1? 研究對象

所有病例方便選自該院癡呆中心，共82例患者，年齡68～91歲，平均（68.3±15.3）歲;所有患者均緩慢起病，就診時平均時間為28個月（9～65）月，納入標準：由至少2名有經(jīng)驗的神經(jīng)科專科醫(yī)師診斷為臨床很可能的AD，AD的診斷依據(jù)為修訂版美國國立神經(jīng)病學、語言障礙和卒中研究所-阿爾茨海默病及相關(guān)疾病協(xié)會（NINCDS-ADRDA）標準。該研究經(jīng)過該院倫理委員會批準，并得到所有家屬或患者的知情同意。

1.2? 認知量表測定

所有AD患者均由?？漆t(yī)師進行臨床癡呆評定量表（CDR）、簡易精神狀態(tài)檢查（MMSE）和蒙特利爾認知評估量表（MoCA）中文版，其中CDR分為輕度（CDR評分=1分）、中度（CDR評分=2分）和重度（CDR評分=3分），MMSE量表包括5部分：定向力、即刻記憶、計算力、短時記憶及語言能力，根據(jù)文化程度得分判斷：文盲≤17分，小學≤20分，初中及以上≤24分存在認知障礙，得分越低越嚴重。MoCA量表包括：注意力和集中，執(zhí)行功能，記憶力，語言能力，視空間，抽象思維，計算，以及定向力。每份MoCA量表限制在10分鐘內(nèi)完成，總分為30分，≥26分為正常，得分越低說明癡呆越嚴重。

1.3? 外周血淋巴細胞DNA端粒長度測定

從肝素抗凝5 mL外周血中分離T、B淋巴細胞，分離過程按制造商說明，分離純度要求達到95%以上。按Rufer描述的方法，通過流式細胞儀測定，染色使用碘化乙胺（PI）（Sigma公司），端粒雜交采用0.3 ug/mL端粒特異FITC共軛粒酸肽探針（FITC為異硫氰酸熒光素）（Biosystem公司），熱變性在Thermomixer上進行（Sigma公司），由FACScan 軟件進行分析，實際熒光強度通過與標準曲線比較，獲得端粒末端長度。采用羅氏公司端粒長度檢測試劑盒檢測外周血細胞端粒長度（TAGGG序列），由于端粒沒有特異性酶切位點，基因組DNA采用限制性內(nèi)切酶的混合酶切法，于0.8%瓊脂糖凝膠5 V/cm電泳4 h后，將凝膠變性、中和，以虹吸印跡法將DNA轉(zhuǎn)移至帶正電的尼龍膜上，烘烤20 min;42℃預雜交1 h后，加入地高辛標記的端粒探針雜交3 h;洗膜后進行化學發(fā)光顯影，所得光片經(jīng)光密度掃描成像，采用端粒長度分析軟件進行分析，計算各樣本端粒長度。

1.4? 統(tǒng)計方法

應用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用配對t檢驗。為了探索線粒體DNA拷貝數(shù)，端粒長度與受試者認知臨床性狀之間的相關(guān)性，我們采用Kaplan-Meier分析生存函數(shù)相關(guān)性檢驗進行分析。所有的檢驗水準為α=0.05，取雙側(cè)檢驗。

2? 結(jié)果

2.1? 不同程度癡呆患者的臨床比較

該研究共收集82例不同程度癡呆患者，均按要求完成神經(jīng)心理測評，根據(jù)癡呆評定量表分值（CDR）發(fā)現(xiàn)有輕度患者18例，中度患者34例，嚴重患者30例。根據(jù)CDR評分，其中輕、中度患者52例，重度患者30例，其MMSE評分和MoCA量表得分見表1。

2.2? 不同臨床癡呆評定量表分值（CDR）與端粒長度的關(guān)系

Kaplan-Meier分析生存函數(shù)曲線圖顯示：每組不同臨床癡呆評定量表分值生存率逐漸下降，輕中度與重度CDR的不同時間生存差異有統(tǒng)計學意義，Log-Rank=1.82，P=0.006。

圖1 輕中度AD患者（1分、2分）患者與重度AD患者（3分患者），其中曲線1表示輕中度，曲線2為重度，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3? 不同程度癡呆患者簡易精神評定量表分值（MMSE）與端粒長度的關(guān)系比較

Kaplan-Meier分析生存函數(shù)曲線圖顯示：每組不同臨床癡呆評定量表分值生存率逐漸下降，輕中度與重度患者的不同時間生存差異有統(tǒng)計學意義，Log-Rank=1.46，P=0.004。

圖2? ?輕中度MMSE得分患者與重度MMSE得分AD患者，其中曲線1表示輕中度，曲線2為重度，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.4? 不同程度癡呆患者MoCA量表得分與端粒長度的關(guān)系比較

Kaplan-Meier分析生存函數(shù)曲線圖顯示：每組不同MoCA評定量表分值生存率逐漸下降，輕中度與重度MoCA分值的不同時間生存差異有統(tǒng)計學意義（Log-Rank=1.28，P=0.005）。

圖3? ?輕中度MoCA得分患者與重度MoCA得分AD患者，其中曲線1表示輕度，曲線2為重度，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3? 討論

端粒是真核生物染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu) ，由富含G的DNA重復序列及其相關(guān)蛋白組成，對于維持染色體穩(wěn)定性具有十分重要的意義，端粒長度決定細胞的壽命，端粒隨著細胞分裂而逐漸縮短，與衰老如癡呆和癌變有密切的關(guān)聯(lián)。 因此，端粒長度縮短被認為是老化的生物標記。2009年諾貝爾生理學與醫(yī)學獎獲得者就是在端粒的研究方面具有突出貢獻，目前有多個研究發(fā)現(xiàn)其與年齡相關(guān)疾病如癡呆之間有關(guān)聯(lián)，隨著全球人口老齡化趨勢加重以及分子生物學的研究進展，老年癡呆的檢出率逐漸增高，而對端粒及其長度研究的不斷深入，AD與端粒之間的聯(lián)系也會逐漸清晰[3]。

正是由于端粒長度與衰老與認知障礙有密切關(guān)系，有研究者認為端粒長度可以預測健康、疾病及衰老死亡。郭令軍等分別提取不同年齡組的外周血DNA，采用實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)40～49 歲組的白細胞端粒（1.5±0.87）kb 長于 60～69 歲組（0.8±0.16）kb（P<0.05），認為隨著年齡增加即使是健康人，其外周血白細胞的端粒也在縮短[4]，也有研究者發(fā)現(xiàn)，年齡與端粒相對長度呈負相關(guān)，而且運動能力及耐力可以反應端粒相對長度的變化，對人體抗衰老和認知障礙有積極的促進作用[5]。

以上研究證實在正常的衰老過程中，端粒長度變在生理性老化中扮演著重要角色，在疾病狀態(tài)中，相關(guān)研究等在對65歲以上老年人的長期隨訪中發(fā)現(xiàn)，隨訪期間死亡者有較短的端粒長度;并且與無癡呆者比較，期間發(fā)展為癡呆者也有顯著較短的端粒長度，提示縮短的外周血白細胞端粒長度與癡呆的風險和死亡率相關(guān)（P<0.05），是早發(fā)癡呆的危險因素[6]。有關(guān)學者的研究也顯示，AD組外周血細胞端粒長度（1.4±0.67）kb顯著短于健康對照組（1.8±0.44）kb（t=11.23，P<0.05），而輕度認知功能障礙（MCI）組（1.7±0.32）kb與健康對照組（1.8±0.44）kb無差別（t=0.92，P>0.05），提示AD病理改變可能進一步加速端粒長度的縮短[7]。本研究通過Kaplan-Meier生存函數(shù)，分析輕、中度與重度AD患者端?？s短的模擬時間函數(shù)，發(fā)現(xiàn)輕中度CDR、MMSE評分患者較重度患者，其生存函數(shù)時間顯著延長，模擬DNA端粒長度具有統(tǒng)計學差異（Log-Rank=1.82，P=0.006;Log-Rank=1.46，P=0.004），具有輕中度MoCA量表評分的AD患者較重度患者，其生存函數(shù)時間顯著延長，模擬DNA端粒長度同樣差異具有統(tǒng)計學意義（Log-Rank=1.28，P=0.005），與上述不同認知功能障礙患者為研究對象，其結(jié)果一致。AD的認知功能下降與抑郁癥有密切關(guān)系，有國內(nèi)學者撰文發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者外周血淋巴細胞（CD4+、CD8+、CD20+）的DNA端粒長度明顯比對照組縮短（t=6.21，P<0.05）[8]，而該研究利用多元統(tǒng)計，模擬從不同認知功能障礙程度闡述端粒時間-速度函數(shù)變化關(guān)系，認為輕中度AD患者較重度AD患者的端粒衰減速度減慢或者具有較長的DNA端粒，進一步說明癡呆與端粒長度縮短有一定量變關(guān)系。

也有證據(jù)顯示在認知功能不同的AD患者中，對比外周血端粒長度后發(fā)現(xiàn)，輕度認知障礙組轉(zhuǎn)變?yōu)锳D組的端粒長度與健康對照組無明顯差異，而穩(wěn)定輕度認知障礙患者的端粒長度反而短，提示AD發(fā)生中的病理過程可能不是由正常生理老化來驅(qū)動[9]。由此可見，衰老、端粒長度與AD這三者之間關(guān)系復雜。但是，端粒長度與衰老關(guān)系，反映人的衰老指標越來越被重視，積極尋找各種類型生物學標志物，是當今認知障礙研究領(lǐng)域迫切面臨且需要解決的問題，端粒長度研究在這方面已經(jīng)具有優(yōu)勢，該研究還需要進一步探討。

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（收稿日期：2019-01-23）