Syn61：合成生物學(xué)的里程碑

編譯 張茜

迄今為止，最大的人工合成基因組已經(jīng)完成，其氨基酸編碼密碼子的數(shù)量比通常要少。這提高了編碼含有非自然氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的可能性。

圖1 大腸桿菌的通用圖片，研究人員重新設(shè)計(jì)了該生物的遺傳密碼

在過去的10年中，化學(xué)合成DNA成本的降低和DNA片段組裝方法的改進(jìn)使得科研人員能夠?qū)⒑铣缮飳W(xué)的規(guī)模擴(kuò)大到產(chǎn)生整個(gè)染色體和基因組的水平。之前，合成DNA已經(jīng)構(gòu)建了多達(dá)100萬堿基對，尤其是一組來自釀酒酵母的染色體和支原體分枝桿菌的多個(gè)版本的基因組?，F(xiàn)在，朱利葉斯·福萊頓斯（Julius Fredens）等人在《自然》雜志上發(fā)表文章，報(bào)道了一個(gè)有著400萬堿基對的大腸桿菌基因組合成版本的完成。劍橋大學(xué)分子生物學(xué)家賈森·秦（Jason Chin）是這篇論文的通信作者。這是合成基因組學(xué)新興領(lǐng)域的一個(gè)里程碑，并最終將該技術(shù)應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的主力細(xì)菌。

合成基因組學(xué)為理解生命規(guī)律提供了一種新方法，同時(shí)也將合成生物學(xué)推向了一個(gè)可以編寫基因組進(jìn)行設(shè)計(jì)的未來。該領(lǐng)域的先驅(qū)——馬里蘭州羅克維爾市克雷格·文特爾研究所的科研人員——已經(jīng)使用這種方法更好地定義了獨(dú)立生存的細(xì)胞所需的最小基因集。通過采用計(jì)算機(jī)重新設(shè)計(jì)基因組片段、化學(xué)合成片段并進(jìn)行組裝的方法，先驅(qū)者們成功地將分枝桿菌基因組的大小縮減了大約50%。根據(jù)以往對大腸桿菌的研究表明，僅僅使用基因組編輯工具進(jìn)行同樣的操作將會(huì)更加費(fèi)力：基因刪除法最多只能刪除基因組的15%。

福萊頓斯和他的同事們利用大腸桿菌的這種簡化版基因組作為合成基因組的模板，同時(shí)也考慮了另一種最小化——密碼子簡化。遺傳密碼存在固有的冗余：共有64個(gè)密碼子（3個(gè)一組的“字母”或堿基），卻只能編碼20個(gè)氨基酸，再加上標(biāo)記蛋白質(zhì)編碼序列開始和結(jié)束的起始密碼子和終止密碼子。這種冗余意味著，例如，有6個(gè)編碼絲氨酸的密碼子，以及3個(gè)可能的終止密碼子。通過設(shè)計(jì)、合成和組裝，福萊頓斯等人能夠在其編碼蛋白質(zhì)的序列中只使用64個(gè)密碼子中的61個(gè)，來構(gòu)造一個(gè)大腸桿菌基因組。他們用同義密碼子（“拼寫”不同，但是能給出相同翻譯指令的密碼子）替換掉了兩個(gè)絲氨酸密碼子和一個(gè)終止密碼子。過去的工作中使用了基因組編輯工具已經(jīng)產(chǎn)生了一種合成大腸桿菌，它只使用64個(gè)密碼子中的63個(gè)，但這只需要將序列為TAG的終止密碼子（基因組中只含有321個(gè)這種終止密碼子）換成另一種終止密碼子。減少到61個(gè)密碼子則需要對多達(dá)18 214個(gè)密碼子進(jìn)行改變，這就必須用到基因組合成方法。

福萊頓斯和他的同事們利用大規(guī)模DNA組裝和基因組整合的方法構(gòu)建了他們的合成大腸桿菌基因組。他們先前已經(jīng)利用這些方法對大腸桿菌中密碼子更改極限進(jìn)行了探索。在他們的方法中，DNA被計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)，化學(xué)合成并組裝成大小為100千堿基的片段，并在釀酒酵母中將其裝入載體；然后，這些載體被轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，并直接整合入基因組對應(yīng)的自然區(qū)域中。將這一過程重復(fù)5次，結(jié)果就是DNA中的500千堿基片段被合成版本所取代。他們用這種方法生產(chǎn)了8株大腸桿菌，每一株都攜帶有合成的DNA片段，涵蓋基因組的不同區(qū)域。然后用接合法將這些片段接合起來，形成完整的合成基因組。

這次大規(guī)模構(gòu)建極其成功，脫靶突變率非常低，但也并非沒有挑戰(zhàn)性。大腸桿菌基因組中的許多基因與其他基因均有部分重疊，在91例重疊區(qū)域中均包含需要進(jìn)行改變的密碼子。這很復(fù)雜，因?yàn)橐粋€(gè)蛋白質(zhì)編碼序列的同義變化有可能會(huì)引起重疊序列編碼的氨基酸的改變。為了解決這個(gè)問題，研究小組“重構(gòu)”了基因組中的79個(gè)位點(diǎn)，復(fù)制序列，將重疊的編碼序列分離成單獨(dú)的編碼序列（圖2）。

最終的菌株被證明可以存活，并能夠在一系列典型的實(shí)驗(yàn)室條件下生長，盡管與野生型相比活力略弱。它不再使用終止密碼子TAG和兩個(gè)絲氨酸密碼子TCG和TCA，因此識(shí)別這些密碼子的細(xì)胞裝置現(xiàn)在就可以被刪除或重新分配，用以募集大多數(shù)活細(xì)胞通常使用的20種氨基酸以外的“非典型”氨基酸。這種招募在63密碼子型的大腸桿菌中已被證明是有用的，從生物技術(shù)項(xiàng)目角度來看，非典型氨基酸被編碼到所需的序列位置，以提供能夠參與自然蛋白質(zhì)所不能參與的化學(xué)反應(yīng)的殘基；從生物安全角度來看，可讀的DNA編碼信息在合成大腸桿菌內(nèi)和外的自然傳輸是有限的，因?yàn)榧?xì)胞的遺傳密碼的運(yùn)作方式與自然界其他生命體略有不同。預(yù)計(jì)所有這些用途都將在新的61密碼子型大腸桿菌中得到擴(kuò)展，該大腸桿菌有潛力編碼使用多個(gè)非典型氨基酸，并生成一個(gè)更為嚴(yán)格的基因防火墻（因?yàn)?4個(gè)密碼子中有3個(gè)不再被識(shí)別）。

合成一個(gè)擁有400萬堿基對的基因組，并將遺傳密碼減少到61個(gè)密碼子，這是合成基因組學(xué)的新紀(jì)錄，但這個(gè)新紀(jì)錄可能不會(huì)維持太久。國際Sc2.0聯(lián)盟即將合成全部16個(gè)染色體共1 200萬堿基對的釀酒酵母基因組——真核生物首個(gè)合成基因組，真核生物包括植物、動(dòng)物和真菌——57密碼子型大腸桿菌基因組的合成工作也正在進(jìn)行中。此外，科學(xué)家們還在構(gòu)建一種比野生型少兩個(gè)密碼子的鼠傷寒沙門氏菌基因組。未來，這可能會(huì)使攜帶合成基因組的細(xì)菌能夠作為基于細(xì)胞的技術(shù)應(yīng)用于人類腸道。

圖2 重編碼基因組的設(shè)計(jì)和構(gòu)建

從技術(shù)的角度來看，所有這些不同的項(xiàng)目的最有趣的方面是合成基因組的工作流結(jié)構(gòu)非常相似——千堿基的合成DNA片段在酵母細(xì)胞中（通過同源重組的過程）被組裝成50到100千堿基的碎片，之后（通過可選擇的重組方法）這些碎片被用來取代靶標(biāo)生物體內(nèi)的自然序列。方法標(biāo)準(zhǔn)化將使步驟自動(dòng)化，更多的研究小組將會(huì)進(jìn)入該領(lǐng)域?；蚪M最小化和密碼子簡化只是這項(xiàng)新技術(shù)的第一個(gè)用途，終有一天這項(xiàng)新技術(shù)將會(huì)幫助我們構(gòu)建出功能重組的基因組和被設(shè)計(jì)用來指導(dǎo)細(xì)胞執(zhí)行特定任務(wù)的個(gè)性化定制基因組。