早熟九葉青花椒的選育與分子鑒定

吳純清，張義剛，程玥晴，阮 林，羅友進(jìn)，陳 霞，謝永紅*

(1.重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 401329；2.重慶市江津區(qū)林業(yè)科技推廣站，重慶 402260)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)是蕓香科(Rutaceae)花椒屬(ZanthoxylumL.)落葉小喬木或灌木，原產(chǎn)我國(guó)。我國(guó)是世界上花椒栽培面積、產(chǎn)量第一的大國(guó)，在日本、韓國(guó)、朝鮮和印度等國(guó)家也有引種栽培[1]。青花椒(Z.schinifoliumSieb.et Zuce)隸屬花椒屬崖椒亞屬，含有大量有效成分，具有抗菌、解痙和鎮(zhèn)靜等作用，因富含川椒素和植物甾醇等而具有非常濃郁的麻香味，常與植物油相配合開(kāi)發(fā)成花椒調(diào)味油、調(diào)味香料和現(xiàn)代副食品加工業(yè)的主要佐料[2～3]。其中九葉青花椒是我國(guó)面積最大、分布最廣、品質(zhì)最好的青花椒主推品種，在重慶、四川、云南、貴州廣泛引種栽培，現(xiàn)已推廣種植面積達(dá)6.7萬(wàn)hm2以上。重慶是九葉青花椒面積和產(chǎn)量最為集中的產(chǎn)區(qū)，全市青花椒實(shí)際種植面積達(dá)5.3萬(wàn)hm2，年產(chǎn)鮮花椒66萬(wàn)t，干花椒17萬(wàn)t。單株優(yōu)選法是選育良種最有效的方法之一[4]。在花椒品種選育與推廣方面，陜西省最早開(kāi)展花椒良種選育工作，四川和云南起步較晚，選育的品種主要為花椒和竹葉花椒，其中四川農(nóng)業(yè)大學(xué)于2012年選育并通過(guò)審定的有漢源花椒和永善青椒1號(hào)，通過(guò)認(rèn)定的有川越西貢椒[5]，貴州省從竹葉花椒人工林中選出黔椒2號(hào)優(yōu)良品種[6]，甘肅開(kāi)展隴南梅花椒無(wú)刺優(yōu)系選育[7]，重慶從野生竹葉花椒中選育出“榮昌無(wú)刺花椒”新品種[8]。針對(duì)九葉青花椒在長(zhǎng)期的栽培和實(shí)生繁殖過(guò)程中出現(xiàn)品質(zhì)退化嚴(yán)重的問(wèn)題。從九青葉花椒實(shí)生繁育群體中選出矮化，早果，豐產(chǎn)，質(zhì)優(yōu)，適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)良單株，通過(guò)區(qū)域試驗(yàn)和擴(kuò)繁，選育出適宜重慶地區(qū)種植的優(yōu)良青花椒品種，為九葉青花椒品種更新?lián)Q代提供品種保障，為促進(jìn)重慶市青花椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2005年到2008年，從江津區(qū)慈云鎮(zhèn)聊月村3組花椒種苗基地用九葉青花椒種子繁育的幼苗中，標(biāo)記其葉片大小，復(fù)葉數(shù)量，樹(shù)干顏色，樹(shù)體高矮等性狀明顯與九葉青花椒有較大差異，初步確定其中202株為變異單株。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

九葉青花椒的良種選育分為3步：(1)初選，2005年9月—2008年12月，根據(jù)九葉青花椒幼苗的形態(tài)特征，以刺節(jié)間距、葉節(jié)間距、芽節(jié)間距、復(fù)葉數(shù)量、葉片面積、葉形指數(shù)等典型指標(biāo)初選獲得13個(gè)變異單株。(2)復(fù)選，2006年1月—2011年12月在江津區(qū)慈云鎮(zhèn)聊月村3組花椒試驗(yàn)基地，以標(biāo)記的13株九葉青花椒實(shí)生變異單株按3 m×3 m株行距定植在試驗(yàn)基地，通過(guò)各單株的生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)、植物學(xué)性狀指標(biāo)、產(chǎn)量指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)獲得2005-2、2007-1、2008-1 3個(gè)豐產(chǎn)變異優(yōu)株。(3)決選，通過(guò)變異優(yōu)株的枝條、葉片和物候期觀測(cè)，獲得2008-1變異單株為矮化、早果、豐產(chǎn)、早熟、大顆粒優(yōu)株，確定為早熟九葉青花椒母本樹(shù)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 經(jīng)濟(jì)性狀指標(biāo)測(cè)定方法

花椒種皮粉末經(jīng)甲醇回流浸提，獲得揮發(fā)性芳香組分，利用HPLC-MS法分離檢測(cè)花椒主要香氣成分，通過(guò)質(zhì)譜掃描進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和比對(duì)分析。

1.3.2 遺傳測(cè)定方法

遺傳變異指數(shù)測(cè)定：根據(jù)九葉青花椒品系典型的滲入雜交(introgressive hybridization)特征，確定變異品種與對(duì)照品種狹翼寬、基部小葉面積、葉形指數(shù)、雌蕊長(zhǎng)、子房形狀指數(shù)、小葉數(shù)、頂端小葉單邊側(cè)脈數(shù)等主要變異性狀指標(biāo)，采用Anderson設(shè)計(jì)的“雜種指數(shù)”(hybrid index)法進(jìn)行花椒性狀變異的定量評(píng)價(jià)?；ń菲贩N性狀變異指數(shù)H計(jì)算公示如下：

式中，Ih為比較品種花椒各性狀雜種指數(shù)值,I1為表中給定的竹葉花椒各性狀的指數(shù)值,A、B分別為表中竹葉花椒、花椒各性狀的最值,X為比較花椒品種各性狀的數(shù)值。

DNA分子鑒定：采用改良的CTAB 法提取花椒DNA，利用SCOT基因標(biāo)記標(biāo)記，對(duì)九葉青花椒的變異株系及其對(duì)照株系進(jìn)行遺傳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)選優(yōu)樹(shù)結(jié)果

2.1.1 變異優(yōu)株早果豐產(chǎn)性性狀表現(xiàn)

在2012—2014年連續(xù)3年對(duì)13個(gè)變異單株進(jìn)行測(cè)定，生長(zhǎng)健壯，無(wú)明顯病蟲(chóng)害，通過(guò)3年的單株產(chǎn)量，平均產(chǎn)量，單位面積產(chǎn)量，千粒重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)2005-2、2007-1、2008-1單株產(chǎn)量超過(guò)九葉青花椒對(duì)照品種，均表現(xiàn)豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，但差異不明顯，其中2007-1、2008-1優(yōu)株都表現(xiàn)出明顯的早果性，定植第1年開(kāi)始掛果。

2005-2、2007-1、2008-1單株花椒果實(shí)均表現(xiàn)為大顆粒型，其中2008-1單株果實(shí)千粒重最高，達(dá)90.9 g，差異顯著(見(jiàn)表1)。

表1 3個(gè)九葉青花椒實(shí)生變異單株產(chǎn)量情況表

Tab.1 The yield of seedling variant plants of Z.armatum var.novemfolius (n=3)

2.1.2 變異優(yōu)株生物形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)

對(duì)3個(gè)變異優(yōu)株的枝條、葉片和物候期觀測(cè)，枝條表現(xiàn)為枝條顏色從深綠色變異為紅褐色，通過(guò)矮化性狀指標(biāo)枝條長(zhǎng)度、枝條直徑、刺節(jié)間距和節(jié)間距的比對(duì)，枝條短壯，刺節(jié)間距和節(jié)間距縮短，其中2008-1表現(xiàn)差異顯著，樹(shù)體矮化明顯，樹(shù)體矮化的原因一是結(jié)果枝縮短，二是枝條節(jié)數(shù)增加、結(jié)果枝節(jié)間距縮短(見(jiàn)表2)；葉片表現(xiàn)為復(fù)葉數(shù)量的增加，葉片寬大，葉面積增加，葉形指數(shù)發(fā)生顯著差異；葉片狹翼也有顯著的加寬變異趨勢(shì)，葉片油胞數(shù)量顯著增加，葉片顏色濃綠(見(jiàn)表3)；物候期表現(xiàn)為2008-1單株萌芽、花期、成熟期均提前5 d～10 d。

表2 3個(gè)九葉青花椒變異優(yōu)株的枝條特征

Tab.2 Branch variability characteristics of optimal variation of Z.armatum var.novemfolius (n=3)

表3 3個(gè)九葉青花椒變異優(yōu)株的葉片特征

Tab.3 Leaf variability characteristics of optimal variation of Z.armatum var.novemfolius (n=3)

2.2 決選優(yōu)樹(shù)結(jié)果

通過(guò)九葉青花椒變異單株初選和復(fù)選綜合評(píng)價(jià)，2008-1變異單株為矮化、早果、豐產(chǎn)、早熟、大顆粒優(yōu)株，確定為早熟九葉青花椒母本樹(shù)。

2.3 決選優(yōu)樹(shù)果實(shí)

果實(shí)顆粒大小變異明顯。通過(guò)早熟九葉青Y1、Y2、Y3代植株鮮花椒顆粒粒徑測(cè)定分析，單粒鮮花椒平均縱徑為6.73 mm～6.93 mm，較對(duì)照品種九葉青花椒單粒平均縱徑5.27 mm增加1.46 mm～1.66 mm；單粒平均橫徑為6.27 mm～6.40 mm，較對(duì)照的5.10 mm增加1.17 mm～1.30 mm。早熟九葉青鮮花椒千粒重為90.91 g～96.15 g，是對(duì)照品種九葉青花椒千粒重55.56g的1.63～1.73倍,比對(duì)照品種大60%以上，且Y1、Y2、Y3代花椒籽粒大果特性與果型指數(shù)穩(wěn)定一致(見(jiàn)表4)。

表4早熟九葉青花椒Y1、Y2、Y3顆粒形態(tài)變異特征

Tab.4ThecharacteristicsofparticlesshapeofZ.armatumvar.novemfolius(Y1,Y2andY3)

品比植株縱徑(mm)橫徑(mm)果型指數(shù)千粒重(g)Y16.93±0.15a6.40±0.10a1.08±0.02a96.15±5.13aY26.73±0.21a6.37±0.23a1.06±0.01a90.91±2.45aY36.77±0.31a6.27±0.06a1.08±0.04a94.34±1.46a九葉青5.27±0.21b5.10±0.20b1.03±0.01a55.56±5.23b

果實(shí)品質(zhì)組分含量較高。通過(guò)花椒種皮主要品質(zhì)指標(biāo)物質(zhì)含量檢測(cè)，早熟九葉青Y1、Y2、Y3代花椒種皮麻味素含量為16.46 mg·g-1～16.55 mg·g-1，較對(duì)照品種提高1.16 mg·g-1～1.25 mg·g-1；揮發(fā)性組分甲醇提取物為18.66%～19.18%，較對(duì)照品種提高0.6個(gè)百分點(diǎn)以上；油性組分乙醚提取物為12.53%～12.93%，蛋白質(zhì)含量為14.87%～15.23%，均較對(duì)照品種提高0.7個(gè)百分點(diǎn)以上。通過(guò)花椒主要品質(zhì)指標(biāo)物質(zhì)含量評(píng)價(jià)，早熟九葉青果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良，麻味純正、含油量高(見(jiàn)表5)。

表5早熟九葉青花椒Y1、Y2、Y3花椒主要品質(zhì)成分含量

Tab.5ThecontentofmainqualitycomponentsofZ.armatumvar.novemfolius(Y1,Y2andY3)

品比植株麻味素含量(mg·g-1)甲醇提取物(%)乙醚提取物(%)蛋白質(zhì)含量(%)Y116.553±0.22a19.16±0.20a12.79±0.29a15.23±0.26aY216.511±0.01a19.18±0.20a12.93±0.33a15.15±0.25aY316.463±0.11a18.66±0.11b12.53±0.10a14.87±0.44ab九葉青15.291±0.19b18.38±0.13b12.05±0.18b14.37±0.14b

果實(shí)香味物質(zhì)豐富。通過(guò)Y1、Y2、Y3早熟九葉青與對(duì)照品種九葉青花椒果實(shí)揮發(fā)性香味物質(zhì)的HPLC-MS分離檢測(cè)結(jié)果表明：對(duì)照品種九葉青花椒共分離檢出75個(gè)香氣組分物質(zhì)， Y1、Y2分離檢出97個(gè)香氣組分物質(zhì)，Y3分離檢出95個(gè)香氣組分物質(zhì)。根據(jù)分離圖譜和各組分的保留時(shí)間分析，在分離的114個(gè)揮發(fā)性組分中，早熟九葉青與對(duì)照品種九葉青有相同組分58個(gè)，變異品種早熟九葉青特異組分39個(gè)，九葉青特異組分17個(gè)。通過(guò)揮發(fā)性組分質(zhì)譜圖對(duì)比分析，兩個(gè)品種都有8個(gè)代表性香氣成分，其中6個(gè)代表性物質(zhì)相同，其保留時(shí)間分別為17.475 min、34.149 min、37.516 min、53.776 min、58.318 min、58.872 min；早熟九葉青品種在5.135 min和63.162 min分別有一個(gè)特異的代表性揮發(fā)性組分，而對(duì)照九葉青在41.408 min和46.766 min分別有一個(gè)特異的代表性揮發(fā)性組分。不同的揮發(fā)性香氣成分組成和比例構(gòu)成了早熟九葉青花椒獨(dú)特的香型，尤其是低分子量(丙酸甲酯、2,4-己二烯醛等)和高分子量(β-谷甾醇、乙酰肼等)香氣成分的增加，提高了早熟九葉青花椒果實(shí)的香氣濃度和醇和度。

2.4 遺傳測(cè)定

2.4.1 性狀變異指數(shù)測(cè)定結(jié)果

通過(guò)早熟九葉青花椒變異形態(tài)指標(biāo)測(cè)定分析，早熟九葉青花椒性狀變異總指數(shù)為23.52，九葉青花椒性狀變異總指數(shù)為22.63。對(duì)比2個(gè)品種各形態(tài)變異指標(biāo)，早熟九葉青基部小葉面積性狀變異指數(shù)差異最大，達(dá)到2.28，其次是葉形指數(shù)，葉片小葉數(shù)、花椒顆粒大小及千粒重性狀變異指數(shù)差異較大，達(dá)到1.70以上；另外葉片狹翼寬也有明顯的變異，其性狀變異指數(shù)為0.82(見(jiàn)表6)。

表6早熟九葉青花椒性狀變異指數(shù)

Tab.6 The variation index of Z.armatum var.novemfolius characters

2.4.2 DNA分子鑒定結(jié)果

利用一種新型目的基因標(biāo)記技術(shù)SCOT(目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性)標(biāo)記，對(duì)早熟九葉青及其對(duì)照品種九葉青花椒進(jìn)行分子遺傳鑒定。從200條引物中篩選出818、865兩條多態(tài)性好的特異引物，通過(guò)特異引物的DNA擴(kuò)增檢測(cè)，與九葉青對(duì)照品種進(jìn)行比較，在兩條特異引物中獲得了兩個(gè)位點(diǎn)的增加或缺失，強(qiáng)度的升高或降低，表現(xiàn)出較大的遺傳變異(見(jiàn)圖1、2)。在818特異引物DNA擴(kuò)增圖譜中，早熟九葉青變種出現(xiàn)一個(gè)800 bp的新增DNA片段，九葉青花椒無(wú)此DNA條帶；在865特異引物DNA擴(kuò)增圖譜中，早熟九葉青變種在 2 000 bp的DNA擴(kuò)增片段極弱，而九葉青花椒擴(kuò)增的 2 000 bp DNA條帶強(qiáng)度十分明顯；說(shuō)明早熟九葉青相對(duì)于對(duì)照品種九葉青花椒在分子水平上發(fā)生了明顯的改變，具備了成為新品種的遺傳基礎(chǔ)。

圖1 早熟九葉青花椒分子鑒定特異引物篩選Fig.1 Screening of specific primers for molecular identification of Zanthoxylum armatum cv.‘Zaoshu jiuyeqinghuajiao’

圖2 早熟九葉青花椒特異引物DNA擴(kuò)增圖譜(1九葉青，2、3為早熟九葉青)Fig.2 Specific primer DNA amplification map of Z.armatum var.novemfolius (1 Z.armatum var.novemfolius,2 and 3 Zanthoxylum armatum cv.‘Zaoshu jiuyeqinghuajiao’)

3 結(jié)論與討論

九葉青花椒歷時(shí)20多年從竹葉花椒中選育出來(lái)[9]，已有近20年的栽培歷史，具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)特點(diǎn)，但生產(chǎn)中已部分表現(xiàn)出品質(zhì)退化嚴(yán)重現(xiàn)象，迫切需要選育高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性佳的九葉青花椒更新?lián)Q代品種。

本研究中，早熟九葉青Y1、Y2、Y3代花椒種皮麻味素含量為16.46 mg·g-1～16.55 mg·g-1，較對(duì)照品種提高1.16 mg·g-1～1.25 mg·g-1；揮發(fā)性組分甲醇提取物為18.66%～19.18%，較對(duì)照品種提高0.6個(gè)百分點(diǎn)以上；油性組分乙醚提取物為12.53%～12.93%，蛋白質(zhì)含量為14.87%～15.23%，均較對(duì)照品種提高0.7個(gè)百分點(diǎn)以上。通過(guò)花椒主要品質(zhì)指標(biāo)物質(zhì)含量評(píng)價(jià)，早熟九葉青果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良，麻味純正、含油量高。2016年11月通過(guò)重慶市林木良種委員會(huì)認(rèn)定，并定名為早熟九葉青花椒。

該品種高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、植株健壯、抗旱性能較佳，褐斑病和葉銹病較輕，非常適合在重慶300 m～800 m及相似氣候條件地方推廣種植，但在其他青花椒種植區(qū)推廣應(yīng)用還需針對(duì)當(dāng)?shù)貧夂颉⒌赜蚝屯寥捞攸c(diǎn)開(kāi)展進(jìn)一步配套栽培技術(shù)研究工作，以適應(yīng)早熟九葉青花椒新品種的推廣。