蔡司Axio Scan.Z1全自動數(shù)字玻片掃描系統(tǒng)的應(yīng)用

尹 偉， 劉雙雙， 鄭艷榕， 張翔南*

(1. 浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 公共技術(shù)平臺， 浙江 杭州 310058； 2. 浙江大學(xué) 藥學(xué)院， 浙江 杭州 310058)

隨著生命科學(xué)研究的深入，對高通量、大視野、大面積樣品分析的需求越來越強烈。玻片掃描系統(tǒng)是利用全自動顯微鏡掃描系統(tǒng)，結(jié)合虛擬切片軟件，將傳統(tǒng)玻璃切片進行掃描和無縫拼接，最終生成一整張全視野的數(shù)字切片[1]，該文件包含了組織切片上所有的組織信息，使傳統(tǒng)物質(zhì)化的載玻片變成新一代數(shù)字化病理切片，這是對病理診斷技術(shù)劃時代的變革。配合自動進樣，可對大量切片進行明場和熒光圖像的分析。優(yōu)勢：數(shù)字切片系統(tǒng)對切片上組織全景掃描，信息全；減少拍照時視野局限性；掃描速度快，圖片清晰；科研人員可脫離顯微鏡，在電腦上即可實現(xiàn)組織切片任意部位任意倍數(shù)(1～400 倍) 的觀察和圖片截?。灰淮纬上裼谰帽４?，減少玻片物理損壞或丟失，熒光猝滅等造成切片的信息缺失。

蔡司的Axio Scan.Z1是研究級全自動數(shù)字玻片掃描系統(tǒng)，是一款集切片自動進樣、裝載、掃描、圖像處理、圖像保存為一體的自動化儀器。樣品夾采用“托盤”設(shè)計，Axio Scan.Z1能夠做到掃描載玻片上的全部標本區(qū)域，包括玻片的邊緣部分。具有操作自動化、運行智能化等特點，質(zhì)量穩(wěn)定、使用壽命長、操作簡便，并可對圖片進行長期保存。僅需幾分鐘時間，自動校正切片掃描 儀系統(tǒng)便可獲得高質(zhì)量的數(shù)字虛擬玻片圖像。具有全自動明場、熒光及偏振光玻片掃描功能，快速又可靠，一次可掃描多達100張常規(guī)玻片。下面介紹該系統(tǒng)的配置參數(shù)及成像特點。

1 配置參數(shù)

1.1 自動玻片進樣系統(tǒng)

單次裝載數(shù)量不小于100片，可連續(xù)追加自動掃描。托盤式樣品夾(可適用于3種玻片規(guī)格：26 mm×76 mm，52 mm×76 mm，或102 mm ×76 mm)。適應(yīng)各種不同標本，包括人腦、猴腦等超大尺寸玻片。

1.2 系統(tǒng)設(shè)計

主機采用箱體式設(shè)計，結(jié)構(gòu)緊湊，箱式結(jié)構(gòu)對玻片起較好的保護作用，系統(tǒng)校準簡單、易操作。

1.3 物鏡

Plan-Apochromat 復(fù)消色差物鏡10×，數(shù)值孔徑NA= 0.45，分辨率0.44 μm/pixel；20×，數(shù)值孔徑NA=0.8，分辨率0.22 μm/pixel；40×，數(shù)值孔徑NA=0.95, 分辨率0.11 μm/pixel，F(xiàn)luar(2.5×, 5×)。

1.4 照明

透射光光源：LED (波長范圍400～700 nm，最高亮度460 nm)；熒光光源：365、385、420、445、470、505、530、590、615、625 nm等。利用斜照明查找焦平面的位置，環(huán)形光闌照明方式，顯著降低光漂白，確保對樣本提供最大限度的保護。濾片轉(zhuǎn)盤：10位帶ACR(自動組件識別功能)的濾片或6位高速激發(fā)濾片轉(zhuǎn)盤；6位高速分光濾片轉(zhuǎn)盤；6位高速發(fā)射濾片轉(zhuǎn)盤。

1.5 雙相機

明場掃描用高色彩還原3芯片CCD相機(型號：Hitachi HV F202SCL)，1600×1200像素有更好的色彩還原。 熒光掃描用高靈敏SCOMS單色照相機(型號：Hamamatsu Flash 4.0)，可提供高速度(4MP)高靈敏度高動態(tài)范圍圖像掃描 (16 bit，100 fps)。

1.6 軟件

ZEN slidescan 軟件模塊專用于拍攝虛擬切片，同時 ZEN 軟件圖像分析工具為研究人員提供精準數(shù)據(jù)。ZEN Lite 軟件包括編輯和瀏覽虛擬切片圖像的功能，可使用總覽圖導(dǎo)航到感興趣的區(qū)域，追蹤任何看過的地方。使用圓形、矩形、線條、箭頭、文本、輪廓圖等對圖像進行標注。可處理CZI、TIFF、JPEG、PNG和GIF等格式的圖片，實現(xiàn)更大兼容性及共享虛擬顯微圖像。從視圖菜單中或圖庫中選擇 2D 模式和直方圖模式，還可以對單個或批量圖像進行銳化、模糊、幾何函數(shù)和顏色調(diào)整處理。

2 成像特點

2.1 明場掃描

以20×物鏡，標準26 mm × 76 mm玻片為例，在薄片樣品尺寸為15 mm×15 mm，分辨率0.22 μm/pixel條件下，掃描得到薄片的概覽圖和明場圖像的時間約為4 min。

2.2 熒光成像

對于多通道熒光成像來說，速度和光照柔和是最重要的。使用Axio Scan.Z1的標準熒光濾色塊，可獲取最多達9個熒光通道的樣本圖像?；蚩墒褂?個同步高速運轉(zhuǎn)的濾片轉(zhuǎn)輪用于激發(fā)、分光和發(fā)射。熒光通道之間切換為50 ms，無需使用三通或四通發(fā)射濾色片。具有獨特的Ring aperture contrast成像模式，在熒光掃描時可以快速進行聚焦地形圖設(shè)置。

2.3 LED光源

Colibri.2 LED光源光照柔和，將樣本的損傷降至更低。

2.4 層掃及景深擴展

具有z-stack及景深擴展功能，且無層數(shù)限制。

2.5 轉(zhuǎn)換速度快

可在毫秒內(nèi)轉(zhuǎn)換激發(fā)的波長，當使用三通或四通濾片時，光路中不會有任何機械部件的移動。

2.6 自動識別和校準

自動識別掃描區(qū)域并校準，從幾何校準到色差校準，數(shù)字虛擬玻片圖像可以在任何時間準確地重現(xiàn)。

2.7 批量掃描

可批量設(shè)置掃描條件(profile)，真正為高通量掃描設(shè)計。

3 蔡司Axio Scan.Z1全自動切片掃描系統(tǒng)的應(yīng)用

目前，蔡司Axio Scan.Z1全自動切片掃描系統(tǒng)應(yīng)用廣泛，如阿爾茨海默病的發(fā)病機制、神經(jīng)科學(xué)、植物生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)、毒理學(xué)，以及熒光原位雜交、偏振掃描等應(yīng)用[2-12]。Dyment等[13，14]將其應(yīng)用于礦化組織的高通量，多圖像冷凍組織學(xué)研究，還可用于高通量研究及預(yù)實驗研究，將不同的顯微技術(shù)進行優(yōu)化，節(jié)省大量時間和資源[15，16]。在實際使用中，我們用蔡司Axio Scan.Z1全自動切片掃描系統(tǒng)，拍攝到熒光腦片、熒光腸切片、明場腎臟組織切片、明場尼氏染色腦切片的完整成像圖片及細節(jié)放大圖片，如圖1～5所示。

3.1 熒光腦片

樣本類型：熒光腦片。通過腦立體定位注射技術(shù)，在小鼠下丘腦腹內(nèi)側(cè)核區(qū)和前腦內(nèi)側(cè)束區(qū)同時注射帶綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的AAV腺相關(guān)蛋白。灌流取腦，冰凍切30 μm腦片，復(fù)染DAPI標記細胞核后，貼片觀察。拍攝物鏡：Plan-Apochromat 10×物鏡(NA=0.45)；拍攝參數(shù)：FL Red-30 ms、FL Green-50 ms、FL Blue-5 ms。利用Axio Scan.Z1全自動切片掃描系統(tǒng)及多色成像功能獲得整張腦片的大視野拼圖，結(jié)合病毒示蹤技術(shù)，感染不同類型的神經(jīng)元，實現(xiàn)某特定腦區(qū)的功能性研究。具體效果見圖1。

圖1 熒光腦片圖(10×) Fluorescence brain slice (10×)

3.2 熒光腸切片

樣本類型：熒光腸切片。拍攝物鏡：Plan-Apochromat 20×物鏡(NA=0.8)；拍攝參數(shù)：FL Red-10 ms、FL Green-10ms、FL Blue-5 ms。利用全自動切片掃描系統(tǒng)及多色成像功能，獲得小腸切片的大視野拼圖，并就感興趣的區(qū)域進行放大，具體效果見圖2。

3.3 熒光腦切片

樣本類型：熒光腦切片。拍攝物鏡：Plan-Apochromat 20×物鏡(NA=0.8)；拍攝參數(shù)：FL Red-1 ms、FL Green-5 ms、FL Blue-5 ms。利用全自動切片掃描系統(tǒng)獲得熒光腦切片的大視野拼圖，并就感興趣的區(qū)域海馬區(qū)放大拍攝，具體效果見圖3。

圖2 熒光腸切片圖(20×) Fluorescence intestinal section (20×)

圖3 熒光腦切片圖(20×)Fluorescence brain slice (20×)

3.4 明場腎臟組織切片

樣本類型：明場腎臟組織切片。拍攝物鏡：Plan-Apochromat 20×物鏡(NA=0.8)；拍攝參數(shù)：TL曝光時間200 μs。利用全自動切片掃描系統(tǒng)明場拍攝，獲得腎臟組織切片的大視野拼圖及感興趣區(qū)域細節(jié)圖，具體效果見圖4。

圖4 明場腎臟組織切片(20×)Bright field renal tissue section (20×)

3.5 明場尼氏染色腦切片

樣本類型：明場尼氏染色腦切片。拍攝物鏡：Plan-Apochromat 20×物鏡(NA=0.8)；拍攝參數(shù)：TL曝光時間200 μs；利用全自動切片掃描系統(tǒng)明場拍攝，獲得尼氏染色腦切片的大視野拼圖及感興趣區(qū)域細節(jié)圖，具體效果見圖5。

圖5 明場尼氏染色腦切片(20×) Bright field Franna Nissl brain slice (20×)

4 儀器使用過程中的常見問題、原因分析及解決方案

4.1 問題一

明場下，無法準確找到焦距。54張明場片子，總共285張腦片，有83張腦片無法找到正確的焦平面，找焦準確度只有71%。原因可能是：經(jīng)測試后發(fā)現(xiàn)在玻璃片上有一層用于固定腦片的明膠(圖6)，明膠層在粗調(diào)焦時被檢測到，并被系統(tǒng)認為是信號進行掃描。而明膠層和腦片信號的距離約為100 μm。解決方案：因無法避免明膠層和不同厚度的玻片影響，需要針對每張片子調(diào)整粗調(diào)范圍。

圖6 明膠層Gelatin layer

4.2 問題二

20×(NA=0.8)物鏡成像效果沒有10×(NA=0.45)物鏡效果好(圖7)。原因可能是10×物鏡的焦深比20×的更大。解決方案：使用10×的物鏡。

4.3 問題三

40×/0.95物鏡拍攝效果不佳(圖8)。原因可能是40×物鏡對于封片劑的折射率和玻片的厚度較為敏感。解決方案：嘗試使用20×/0.8物鏡。

圖7 10×物鏡與20×物鏡的成像對比圖 Imaging contrast picture of 10× objective lens and 20× objective lens

圖8 40×物鏡(NA=0.95)成像效果圖40×objective lens (NA=0.95) imaging figure

5 結(jié)語

全自動切片掃描技術(shù)優(yōu)勢巨大，應(yīng)用范圍廣，已逐步成為形態(tài)學(xué)研究和病理學(xué)的一種變革性輔助手段。蔡司Axio Scan.Z1全自動切片掃描系統(tǒng)使用頻率較高，能實現(xiàn)全自動化掃描。對于樣本數(shù)量較大的用戶，極大地節(jié)省了時間成本和人力。儀器的機箱式設(shè)計能保證整個系統(tǒng)的穩(wěn)定性，避免因外界環(huán)境引起的掃描問題。拍攝同批次的玻片，因均設(shè)置相同的“Profile”，能保證所有樣本的參數(shù)一致性。但是，使用過程中存在一個較大的問題：對于制片較臟或不佳的樣本，找不到正確的焦平面。這是因為該儀器是全自動化的掃描方式，不存在手動對焦的策略，不能人為地調(diào)整焦平面。此外，由于玻片的厚度及樣本均存在差異，使用相同的參數(shù)設(shè)置不利于系統(tǒng)準確找到焦平面。根據(jù)拍攝經(jīng)驗，針對一些不容易找到焦平面的樣本，我們建議通過控制粗調(diào)焦的范圍，采取增加聚焦點個數(shù)，進行調(diào)整拍攝。