轉錄因子FoxO1在糖尿病心肌缺血再灌注損傷中作用的研究進展

周 璐，王雅楓，蘇娃婷，雷少青

(武漢大學人民醫(yī)院麻醉科，武漢 430060)

糖尿病是一種嚴重危害人類身體健康的慢性疾病，我國是糖尿病的發(fā)病大國。缺血性心臟病是導致糖尿病患者死亡的最主要原因之一[1]。在臨床上，有效恢復缺血心肌的血液灌注是治療缺血性心臟病的根本途徑。然而，缺血心肌在恢復血液灌注后其缺血性損傷進一步加重，即心肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)。循證醫(yī)學研究進一步顯示，糖尿病患者較非糖尿病患者更不易耐受IRI，即糖尿病心肌缺血易損性增加[2]。盡管目前關于糖尿病心肌缺血易損性增加的機制還不清楚，但心肌代謝改變可能是糖尿病IRI發(fā)生、發(fā)展過程中的重要機制。叉頭轉錄因子O亞型1(Forkhead transceiption factor of class O1,FoxO1)是調控心肌代謝的重要因子，同時也是胰島素信號通路中的關鍵轉錄因子。在糖尿病狀態(tài)下FoxO1過度活化?，F(xiàn)對FoxO1過度活化調控心肌代謝并導致糖尿病心肌缺血再灌注易損性增加的相關機制進行綜述，為臨床治療和保護糖尿病患者心肌缺血提供潛在新靶點和依據。

1 FoxO1的結構與活性調節(jié)

1.1 FoxO1轉錄因子簡介 FoxO轉錄因子家族屬于進化上高度保守的轉錄調節(jié)因子Fox(A～S)19個超家族其中之一，由FoxO1(FKHR)、FoxO3(FKHRL1)、FoxO4(AFX)和FoxO6蛋白組成[3]。FoxO亞家族各自的表達部位不同，F(xiàn)oxO1主要表達于肝細胞、脂肪細胞、胰島β細胞；FoxO3a在腫瘤細胞和腎臟中表達占主導地位；FoxO4在肌肉組織中表達豐富[4]，F(xiàn)oxO6主要存在于發(fā)育中的大腦[5]。FoxOs廣泛存在于生物體中，參與多種細胞的生理過程，如細胞增殖、細胞凋亡、活性氧類(reactive oxygen species,ROS)反應、長壽、癌癥、細胞周期和新陳代謝的調節(jié)等[6]。

FoxO蛋白的一個共同特征就是具有由110氨基酸組成的DNA結合域，是起調節(jié)作用的主要結構，由4個螺旋(H1、H2、H3和H4)，2個翼環(huán)(W1、W2)和3個β鏈(S1、S2、S3)組成[7]。在該結構域中，Helix-3是主要的DNA識別元件，其包含高度保守的N-X-X-R-H-X-X-C/T序列，促使其與DNA螺旋槽結合。FoxOs還含有核定位序列、核輸出序列和含有反式激活結構域的C端[8]。研究表明，F(xiàn)oxO1可與Daf-16結合元件的5′-GTAAA (T/C) AA-3′序列和胰島素反應序列5′-(C/A) (A/C) AAA(C/T) AA-3′結合[9]。FoxO1與下游DNA相互結合的復雜位點是FoxO1活性調節(jié)的結構基礎。

1.2 FoxO1轉錄活性的調節(jié) FoxO1轉錄活性主要受磷酸化、乙?；头核鼗揎椃绞降恼{節(jié)。①磷酸化修飾：FoxOs由各種蛋白激酶磷酸化來修飾調節(jié)FoxOs轉錄因子的位點，改變FoxO1的亞細胞定位、與DNA分子結合的親和能力和轉錄活性[10-11]。FoxO1是胰島素/胰島素樣生長因子1信號通路下游的關鍵轉錄因子[12],其活性主要受上游磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)調節(jié)，胰島素/胰島素樣生長因子1信號通路的激活使PI3K催化形成磷酰肌醇-3,4,5-三磷酸，激活Akt?；罨腁kt繼而磷酸化FoxO1的Thr24、Ser256和Ser319三個磷酸化位點，引起FoxO1轉錄因子磷酸化[13]。磷酸化的FoxO1蛋白可特異性的與14-3-3蛋白結合，削弱了FoxO1蛋白與DNA的結合能力，從而使FoxO1轉錄因子從核DNA錨定位點釋放出來，從細胞核轉運到細胞質,從而導致FoxO1的轉錄活性下降，抑制FoxO1調控下游基因的表達活性[14]。PI3K/Akt活性減弱時，F(xiàn)oxO1呈去磷酸化狀態(tài)，使其重新定位于細胞核，F(xiàn)oxO1轉錄活性增強。此外，蛋白激酶Cδ和c-Jun氨基端激酶等通過阻止磷酸化的FoxO1和14-3-3蛋白的相互結合，增強FoxO1的核定位[15-16],使FoxO1轉錄活性增強，見圖1。②乙?；揎棧篎oxO1的乙?；揎棸l(fā)生在DNA結合區(qū)的賴氨酸殘基上，這3個賴氨酸殘基分別為Lys242、Lys245和Lys262。乙?；蟮腇oxO1與DNA結合區(qū)的活性降低，導致其轉錄活性降低。然而，沉默信息調節(jié)因子(silent information regulator,Sir)2是一種去乙?；?，Sirt1是哺乳動物具有的7種 Sir2的其中之一。Sirt1可以催化FoxO1去乙?；瘡亩种破滢D錄活性。③泛素化修飾：FoxO1蛋白的Ser256位點發(fā)生磷酸化后能夠被Skp/Cul/F-box 蛋白泛素復合體識別后聚泛素化，泛素化作用后的FoxO1蛋白會通過蛋白酶體的解蛋白作用而降解[17]。

PI3K:磷脂酰肌醇-3-激酶;Akt:蛋白激酶B;Phosphate group:磷酸鹽組;Cytosol:細胞質；Nucleus:細胞核；Nucleus export：核輸出；Nucleus import：核轉入；increased transcription：增加轉錄；decreased transcription:降低轉錄

2 FoxO1與糖尿病代謝

糖尿病是一組以高血糖為主要特征的代謝性疾病。其發(fā)病機制為機體內胰島素分泌不足或機體利用胰島素障礙(胰島素抵抗)，而糖代謝、脂代謝異常是引起糖尿病及其心血管并發(fā)癥的重要環(huán)節(jié)。如上所述，F(xiàn)oxO1主要表達在胰島β細胞等[4]，這些組織是胰島素分泌的主要部位，且與機體的糖脂代謝高度相關。

2.1 FoxO1與糖代謝 機體通過外周組織和內源性葡萄糖的產生、攝取、異生和分解來維持全身葡萄糖的穩(wěn)態(tài)，肝臟是機體葡萄糖代謝的主要器官。FoxO1是胰島素信號轉導和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的主要調節(jié)因子[18]。肝臟糖異生由葡萄糖6-磷酸酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶兩種關鍵酶控制[3]。在肝細胞中，F(xiàn)oxO1活化可以激活葡萄糖6-磷酸酶與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶糖異生基因的轉錄，參與調控血糖水平[18]。在進食狀態(tài)下，胰島素激活胰島素受體PI3K/Akt,Akt磷酸化FoxO1,導致FoxO1離開細胞核而影響其轉錄活性，抑制糖異生；而在禁食狀態(tài)下，胰島素的信號較弱，F(xiàn)oxO1在Akt位點去磷酸化定位到細胞核中，從而誘導兩種糖異生關鍵酶(葡萄糖6-磷酸酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)的轉錄，促進肝臟糖異生，重建血糖穩(wěn)態(tài)。除葡萄糖6-磷酸酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶外，F(xiàn)oxO1還可以調節(jié)丙酮酸脫氫酶激酶4等糖異生相關基因[19]。丙酮酸脫氫酶激酶4使丙酮酸脫氫酶復合物的亞基磷酸化，抑制其向乙酰輔酶A轉化，導致丙酮酸從三羧酸循環(huán)或脂肪酸合成轉向糖原異生。因此，F(xiàn)oxO1有助于在饑餓期間維持正常的血糖水平[12]，而在胰島素抵抗或糖尿病的條件下，由于缺乏胰島素信號轉導的調控，過度活躍的FoxO1以不受控方式持續(xù)促進糖異生，從而導致高糖血癥，最終參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展[20-21]。

2.2 FoxO1與脂代謝 FoxO1參與脂質代謝并在糖尿病脂質代謝紊亂中起關鍵作用[22]。極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)在肝臟中組裝和生成，并且受胰島素的嚴格調節(jié)。禁食條件下誘導肝VLDL的生成，導致血液中VLDL增加，而餐后胰島素的釋放會抑制肝VLDL的產生限制血漿三酰甘油的累積。FoxO1在微粒體三酰甘油轉運蛋白和載脂蛋白C-Ⅲ的胰島素依賴性調節(jié)中起關鍵作用，微粒體三酰甘油轉運蛋白與載脂蛋白C-Ⅲ分別為催化三酰甘油脂蛋白的生產和清除中的限速步驟[23]。胰島素作用減弱時增加FoxO1活性，誘導微粒體三酰甘油轉運蛋白有利于VLDL的組裝，并誘導載脂蛋白Ⅲ減少外周三酰甘油分解代謝。在糖尿病受試者中，由于肝臟中的胰島素抵抗，F(xiàn)oxO1過度活化，胰島素抑制VLDL的能力受損，導致過量的VLDL分泌和血液中三酰甘油顆粒的累積，這種糖尿病脂質代謝異常表現(xiàn)為高三酰甘油血癥[24]。

3 FoxO1與糖尿病心肌IRI的關系

3.1 FoxO1在維持正常心肌功能中的作用 正常水平的FoxO1是調節(jié)心臟穩(wěn)態(tài)的重要組分，是維持心肌細胞正常代謝和存活的關鍵。研究顯示，F(xiàn)oxO1缺乏引起血管和心臟發(fā)育不全，導致小鼠胚胎在10.5～11 d死亡[25]。FoxO1-/-胚胎還表現(xiàn)為發(fā)育不全的主動脈和心臟循環(huán)受損[26]。另有研究顯示，心臟中FoxO1的缺失會誘導增加NaV1.5的表達導致Na+負荷增加和缺血性心臟病的發(fā)生[27]。

然而，F(xiàn)oxO1過度活化會導致心臟功能障礙。Qi等[28]研究發(fā)現(xiàn)FoxO1與肌球蛋白重鏈基因的啟動子區(qū)域相互作用并刺激其表達，促進心臟肥大和損害心臟的收縮性最終導致心力衰竭。另有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌FoxO1過度活化促進誘導型一氧化氮合酶的表達，進一步誘導靶蛋白如甘油醛-3-磷酸脫氫酶和胱天蛋白酶-3的亞硝基化，導致高血糖后心肌細胞死亡，從而導致糖尿病心肌功能紊亂[24]。

3.2 FoxO1過度活化導致機體代謝紊亂 FoxO1在調節(jié)心肌代謝中尤為重要。FoxO1活性受胰島素負性調節(jié)，胰島素通過Akt依賴途徑使FoxO1磷酸化，這引起14-3-3蛋白與FoxO1磷酸化部位相結合隨后從細胞核轉運到細胞質，從而降低FoxO1的轉錄調控能力。在糖尿病狀態(tài)下，F(xiàn)oxO1活化可增加心肌脂肪酸的攝取及氧化，同時抑制葡萄糖氧化利用率，這會引起心肌脂肪酸蓄積，當脂肪酸攝入量超過心肌細胞脂肪酸代謝能力時，將導致細胞線粒體功能紊亂而產生過量ROS致細胞損傷。ROS一方面可直接導致組織器官的氧化損傷，另一方面可造成機體一氧化氮合酶系統(tǒng)異常，包括內皮型一氧化氮合酶脫偶聯(lián)與誘導型一氧化氮合酶過表達，由此造成的后果是機體不僅不能催化產生具有生物活性的一氧化氮，相反會誘導產生ROS具有更強蛋白硝基化能力與細胞毒性的過氧亞硝基陰離子,從而加重心肌損傷，這可能是糖尿病心臟不易耐受IRI的主要原因[29]。

4 FoxO1與糖尿病心肌IRI

目前治療糖尿病患者缺血性心臟病的主要措施是恢復缺血心肌的有效動脈血液灌注，而缺血心肌在恢復血流灌注后其缺血性損傷進一步加重，即心肌IRI。有研究顯示，在小鼠的糖尿病心肌IRI模型中，適度上調心臟中FoxO1的表達可減輕心臟損傷，而當糖尿病心臟過度表達或者FoxO1的缺失會加劇缺血再灌注誘導的心肌損傷[30]。Guo等[31]研究顯示，糖尿病狀態(tài)心臟的FoxO1蛋白過度活化表達,糖尿病狀態(tài)增加了心肌對IRI的易感性，而FoxO1表達下調提高了糖尿病心臟對IRI的耐受性。然而過度活化的FoxO1蛋白通過中的氧化應激、自噬、凋亡等過程參與糖尿病心肌IRI。

4.1 FoxO1與糖尿病心肌IRI有關的氧化應激 FoxO1是細胞應對氧化應激反應的關鍵介質。線粒體是細胞內ROS的主要來源。胰島素等因子均可通過激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶或線粒體途徑增加ROS的生成。過量的非生理濃度的ROS會導致氧化應激。而心肌細胞在受到IRI時會產生大量的自由基，導致DNA、RNA、蛋白質和多糖的氧化、交聯(lián)、變性和降解，最終導致細胞的死亡。細胞的抗氧化能力降低或增強時也會發(fā)生氧化應激。FoxO轉錄因子調節(jié)編碼細胞內和細胞外抗氧化蛋白基因的表達,一方面FoxOs可刺激編碼線粒體內超氧化物歧化酶2、過氧化物酶3等抗氧化蛋白基因的轉錄，另一方面ROS形成的應激刺激可以通過FoxOs的磷酸化和乙?；确g后修飾改變FoxO蛋白的亞細胞定位[32]。

4.2 FoxO1與糖尿病心肌IRI有關的凋亡 細胞凋亡是決定IRI程度的特征性變化之一[33]。線粒體氧化損傷是IRI期間氧化應激增加的結果，同時這種損傷反過來會加劇IRI[34]。線粒體氧化損傷引起的線粒體通透性改變、線粒體腫脹、促凋亡蛋白釋放和線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)等一系列變化，導致線粒體結構和功能障礙最終會引起心肌細胞的凋亡。心肌氧化應激增加和抗氧化應激能力降低可使糖尿病心臟易于發(fā)生IRI誘導的細胞凋亡[35]。據報道，在糖尿病期間FoxO1通過增加胱天蛋白酶和細胞死亡受體的表達能力導致細胞死亡,除傳統(tǒng)途徑，F(xiàn)oxO1還可直接增加一些促凋亡蛋白如Bim、Puma的表達[36]。

在心肌細胞IRI過程中，Sirt1調節(jié)的FoxO1乙?；接绊懶呐K中凋亡途徑。Hsu等[37]研究顯示，Sirt1通過上調抗氧化分子和激活FoxO1來下調促凋亡分子來減少氧化應激，保護心臟降低IRI。

4.3 FoxO1與糖尿病心肌IRI有關的自噬 自噬是一種細胞程序性的死亡方式，線粒體自噬是細胞清除損傷或衰老線粒體的主要途徑[38]，線粒體自噬歸屬于自噬。有研究表明，IRI與自噬特別是線粒體自噬功能紊亂密切相關[39]。

`機體在糖尿病狀態(tài)下，心肌代謝發(fā)生紊亂，葡萄糖利用受到限制，心臟轉而主要利用脂肪酸氧化供能。而細胞攝入的脂肪酸濃度超過其代謝能力時，則會導致脂肪酸蓄積。心肌細胞利用脂肪酸過多時可導致脂毒性心功能紊亂及心臟不易耐受IRI[40]。FoxO1對脂肪酸的攝取調節(jié)使其成為心臟功能的重要參與者[36]。

心肌細胞在缺血狀態(tài)時，機體清除ROS的能力減弱，而心肌細胞再次恢復血液供應時，ROS大量產生甚至出現(xiàn)堆積，堆積的大量ROS對心肌細胞會造成直接傷害，并會導致線粒體的損傷，使線粒體產生更多的ROS，造成一種惡性循環(huán)[39]。

PINK1(PTEN induced putative kinase)是FoxOs的潛在靶點[41]，研究表明FoxO1主要通過與PINK的啟動子結合發(fā)揮作用[42]。ROS等引起線粒體損傷時，阻礙PINK1從線粒體外膜進入體腔，使PINK1聚集于線粒體外膜。此時PINK1會招募Parkin到線粒體，E3泛素鏈接酶被激活，通過泛素化底物以激活線粒體自噬[43]。

通過適當增強線粒體自噬水平可減輕心肌IRI，而當損傷的線粒體數量超過其清除能力或機體線粒體自噬發(fā)生缺陷時，細胞會啟動程序性死亡，加重心肌缺血再灌注的損傷程度[44-45]。

4.4 FOXO1與糖尿病心肌IRI有關的內質網應激 缺血等壓力因素破壞內質網功能，導致蛋白質的錯誤折疊和展開，內質網中錯誤折疊和未折疊的蛋白質累積即被稱為內質網應激[46]。內質網應激是糖尿病心肌病發(fā)病機制中的重要因素，過度的內質網應激可導致心肌細胞凋亡[47]，并有證據表明FoxO1過度激活與過度的內質網應激相互交織[36]。FoxO1是內質網應激的上游調節(jié)因子[36]。RNA結合蛋白QKI5使FoxO1的mRNA不穩(wěn)定，進而可以抑制心肌細胞中FoxO1的表達和活化[48]。在QKI5缺失的心臟中，F(xiàn)oxO1過度激活并隨之放大內質網應激，增強糖尿病心臟IRI的不耐受性，而糖尿病心臟中QKI5的恢復可顯著減輕IRI[31]。

5 小 結

FoxO1活化是糖尿病性心肌病發(fā)展的核心[49]。馮世棟等[50]研究顯示，在糖尿病小鼠心肌點注射FoxO1 siRNA來下調FoxO1表達的心肌缺血再灌注模型中，可以減輕心肌IRI。在細胞實驗中，高糖孵育乳鼠心肌細胞會造成細胞內FoxO1表達量增高，加重心肌細胞缺氧/復氧后細胞損傷，轉染FoxO1 siRNA的細胞內FoxO1表達量下降導致缺氧/復氧損傷減輕[51]。 FoxO1抑制劑AS1842856發(fā)揮空腹降糖作用并改善糖耐量[52]和逆轉小鼠心臟不利重塑和改善收縮功能，從而提出糖尿病心肌心肌IRI是多方面綜合作用的結果[53]。FoxO1作為其信號通路的共同作用靶點，參與的氧化應激、凋亡、自噬和內質網應激等在糖尿病IRI過程都發(fā)揮重要作用。糖尿病心肌缺血再灌注也是臨床醫(yī)師經常面臨的情況，隨著FoxO1在糖尿病心肌IRI的闡述，進一步了解FoxO1轉錄因子的作用機制，將會為臨床治療糖尿病患者心肌IRI提供的靶點與臨床依據。