無細(xì)胞百日咳疫苗時代百日咳桿菌黏附素蛋白缺失株的研究進(jìn)展

高振軒，諶志筠，何秋水

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2015級五年制臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，北京 100069； 2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，北京 100069；3.芬蘭圖爾庫大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物和免疫學(xué)系，圖爾庫 20520)

百日咳是由百日咳桿菌引起的一種急性呼吸道傳染病，人群普遍易感。百日咳以陣發(fā)性痙攣性咳嗽、咳嗽后嘔吐、雞鳴樣吼聲為典型臨床癥狀，可持續(xù)2～3個月，嬰幼兒患百日咳可導(dǎo)致嚴(yán)重后果，是我國法定乙類傳染病。百日咳疫苗的接種覆蓋率雖已很高，近年來，全球許多國家和地區(qū)的百日咳發(fā)病率卻有明顯上升的趨勢，局部地區(qū)甚至出現(xiàn)暴發(fā)流行，稱為“百日咳再現(xiàn)”[1-2]。除了臨床醫(yī)師診斷意識的提高、先進(jìn)的實(shí)驗室方法[細(xì)菌培養(yǎng)、特異的百日咳桿菌核酸放大方法和血清百日咳毒素(pertussis toxin，PT)特異抗體檢測法等]的使用以外，疫苗接種后產(chǎn)生的免疫力的衰減和百日咳桿菌變異被認(rèn)為是導(dǎo)致“百日咳再現(xiàn)”最重要的原因之一。大量研究證明，病原菌在不同的免疫接種策略下會出現(xiàn)不同程度的變異以適應(yīng)選擇壓力，稱為“病原菌適應(yīng)現(xiàn)象”[3-7]。近年來，在無細(xì)胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccines，ACVs)普及率較高的國家中，百日咳桿菌黏附素蛋白(pertactin，Prn)缺失株的出現(xiàn)和增加，引起了全球極大關(guān)注[8]。我國ACVs的使用和普及較晚[3,9]，對Prn缺失株還缺乏較為系統(tǒng)的研究和認(rèn)識?，F(xiàn)就近年來國內(nèi)外百日咳桿菌Prn缺失株的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 百日咳疫苗的種類及特點(diǎn)

1.1 全球百日咳疫苗的種類和特點(diǎn) 百日咳疫苗主要分為全細(xì)胞百日咳疫苗(whole-cell pertussis vaccines，WCVs)和ACVs兩種。WCVs的主要制作方法，是將百日咳桿菌全菌體滅活后，再與適當(dāng)佐劑配伍。20世紀(jì)20年代，經(jīng)臨床試驗證實(shí)有效性后，WCVs在全球范圍內(nèi)被廣泛用于兒童初次免疫及加強(qiáng)免疫。在實(shí)施擴(kuò)大免疫計劃的國家和地區(qū)，隨著接種覆蓋率的提高，百日咳發(fā)病率下降超過90%，一度得到了很好的控制[10]。但隨著時間的推移，WCVs的缺點(diǎn)逐漸顯現(xiàn)。比如，不同批次間的質(zhì)量不易把控，接種后可能出現(xiàn)嚴(yán)重的全身反應(yīng)，甚至出現(xiàn)腦炎、癲癇等，對嬰幼兒可能造成嚴(yán)重的后果甚至死亡[8,10]。為了降低接種疫苗后的不良反應(yīng)發(fā)生率，自20世紀(jì)80年代，日本最先開始使用ACVs替代WCVs。ACVs的制作方法，主要是通過提純?nèi)サ粢恍┠芤鸩涣挤磻?yīng)的無用的物質(zhì)，保留具有免疫原性的百日咳桿菌抗原成分。目前，世界上使用的ACVs包括以下幾種。ACV1：僅含PT一種抗原。ACV2：含PT和絲狀血凝素(filamentous hemagglutinin，F(xiàn)HA)兩種抗原。ACV3：含PT、FHA和Prn三種抗原。ACV5：含PT、FHA、Prn、菌毛蛋白2(fimbriae，F(xiàn)IM2)和FIM3五種抗原。研究表明，含有Prn的ACVs比不含Prn的ACVs能誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫保護(hù)力，因此國際上使用的ACVs多含有Prn成分[11]。目前普遍使用的是ACV3。

1.2 我國ACVs的種類和特點(diǎn) 我國自20世紀(jì)60年代開始應(yīng)用WCVs，2007年開始使用ACVs替代WCVs，并于2012年完成ACVs大面積覆蓋接種[9,12]。根據(jù)《中華人民共和國藥典》(三部)的要求，我國采用的各ACVs生產(chǎn)菌株以CMCC 58003(CS株)為主，采用共純化生產(chǎn)工藝，經(jīng)過鹽析和離心收集PT、FHA，并作為有效組分制成ACVs原液，之后與破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素合并并稀釋[13]。由于兩種抗原成分是共同提取的，因此缺乏分別定量的工作，且有可能含有其他百日咳桿菌來源的抗原成分[14]。

1.3 ACVs誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答特點(diǎn)及可能后果 雖然ACVs的接種在降低不良反應(yīng)發(fā)生率的同時保留了疫苗的免疫原性，誘導(dǎo)單個抗原的特異性抗體的滴度較高，但大量研究證實(shí)，ACVs誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答僅針對少數(shù)抗原，不如WCVs廣泛；接種ACVs后的免疫保護(hù)力持久性相比WCVs進(jìn)一步下降；ACVs的使用有可能導(dǎo)致疫苗所含抗原表達(dá)缺失的菌株的流行[8,15]。

2 “百日咳再現(xiàn)”及可能原因

20世紀(jì)50年代以來，百日咳疫苗的使用很大程度上降低了百日咳的發(fā)病率和死亡率。盡管如此，百日咳仍然是全球范圍內(nèi)最流行的疫苗可預(yù)防性疾病之一。近年來，在很多發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家，百日咳的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢。英國、美國、澳大利亞、比利時等國家都有過疫情暴發(fā)的報道[2,16-18]。我國的百日咳疫苗接種覆蓋率從1983年的58%上升到了2012年的99%，1990年以來，我國百日咳報告發(fā)病率低于十萬分之一，防控措施取得了良好成效。但是，據(jù)我國國家衛(wèi)生健康委員會統(tǒng)計，2015年、2016年及2017年全國百日咳報告發(fā)病數(shù)分別為6 658例、5 681例和10 390例，相比2014年以前(報告發(fā)病數(shù)在1 612～3 408例不等)，近三年的報告發(fā)病數(shù)明顯增多。截止到2018年底，已經(jīng)報告百日咳22 057例[3,19]。

導(dǎo)致“百日咳再現(xiàn)”的原因，包括臨床醫(yī)師對疾病重視程度增加，診斷意識提高；先進(jìn)的實(shí)驗室診斷技術(shù)的推廣應(yīng)用，監(jiān)測系統(tǒng)敏感性提高；接種疫苗后的免疫力衰減導(dǎo)致青少年及成人發(fā)病人群增加，成為嬰幼兒百日咳感染的重要傳染來源；百日咳桿菌變異影響疫苗接種的有效性等[20]。

3 Prn缺失株的發(fā)現(xiàn)及流行現(xiàn)狀

3.1 “Prn缺失株”的發(fā)現(xiàn)和流行 值得關(guān)注的是，近幾年出現(xiàn)的流行菌株中，有的不表達(dá)ACVs所包含的抗原成分，PT、Prn、FHA以及FIM等均可缺失[21]，而其中又以Prn缺失最為常見，這類菌株被稱為“Prn缺失株”。Prn缺失株于2003年在法國被首次發(fā)現(xiàn)，之后越來越多的Prn缺失株從各個國家的臨床流行菌株中被發(fā)現(xiàn)，甚至可能造成百日咳暴發(fā)流行[12]。根據(jù)2014年的一項加拿大九省菌株樣本調(diào)查研究顯示，最早在2011年收集的標(biāo)本中，僅Ontario一個省出現(xiàn)Prn缺失株，而到2012年就已增加為兩個省，Ontario省的Prn缺失株占比更是達(dá)到了60%[22]。根據(jù)澳大利亞的一項研究報道，2008—2012年澳大利亞百日咳暴發(fā)時期收集的菌株中，Prn缺失株的比例從最初的5%迅速上升至78%[23]。2012年，在美國華盛頓州百日咳大暴發(fā)時期分離的菌株中，Prn缺失株所占比例超過了60%[12]，可見Prn缺失株在某些發(fā)達(dá)國家的流行趨勢已經(jīng)十分嚴(yán)峻。

我國目前尚未發(fā)現(xiàn)Prn缺失株。但據(jù)近期的一篇國內(nèi)的研究報道，2013—2014年收集的99個病例樣本中，出現(xiàn)了以prn2基因型為主的菌株，與ACVs抗原的基因型不同[7]。因此，是否會出現(xiàn)Prn缺失株，仍值得我國在百日咳預(yù)防工作中提高警惕，并加強(qiáng)對我國流行菌株分子生物學(xué)特征的監(jiān)測，重視國家和地區(qū)以Prn缺失株為首的疫苗抗原缺失菌株的流行問題。

3.2 Prn缺失株的特點(diǎn) Prn是一種外膜表面相關(guān)蛋白，屬于自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，具有較高的免疫原性，是很多ACVs的重要成分之一。Prn蛋白是由prn基因編碼的一個分子量為93 000的前體多肽，經(jīng)過水解后獲得的一個分子量為63 000的蛋白，擁有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列三聯(lián)肽結(jié)構(gòu)，可促進(jìn)百日咳桿菌對宿主細(xì)胞的黏附作用，使之侵入到呼吸道黏膜纖毛上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞，從而增強(qiáng)百日咳桿菌的侵襲力。同時，Prn還具有逃避中性粒細(xì)胞清除以及免疫調(diào)節(jié)的作用[8,24]。

根據(jù)美國、澳大利亞等國學(xué)者的大量臨床研究和實(shí)驗室數(shù)據(jù)顯示，與表達(dá)Prn的菌株相比，Prn缺失株對宿主的侵襲力和致病性并無明顯的差別。在6個月以下的嬰兒和動物模型中，Prn缺失株的毒力、致病性等與正常菌株相比無明顯差異，對引起常見的百日咳臨床癥狀(咳嗽、上呼吸道感染、百日咳嘔吐等)也無明顯影響[15,23,25-26]。在最近的一項研究中，將國際標(biāo)準(zhǔn)菌株Tohama Ⅰ型衍生菌株敲除編碼Prn的基因，所得到的Prn缺失株與原菌株相比，可刺激人體和小鼠的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生更多促炎性細(xì)胞因子，增加細(xì)胞的死亡。但從臨床分離出的 Prn缺失株卻并未觀察到這個現(xiàn)象[27]。因此可以推斷，百日咳桿菌中Prn的作用可以被其他毒力因子代償。但具體的分子機(jī)制尚不十分明確[8,15,26]。

3.3 Prn缺失株出現(xiàn)的可能的分子機(jī)制 Prn缺失株產(chǎn)生的可能的分子機(jī)制主要包括：prn啟動子倒位；IS481插入序列的插入；prn基因單核苷酸多態(tài)性導(dǎo)致引入終止密碼子，使蛋白翻譯提前終止；單核苷酸插入導(dǎo)致移碼突變；prn部分基因缺失，以及prn部分基因缺失后被另一片段取代[15,28]。其中，以IS481序列插入最為常見。原因可能是IS片段對于百日咳桿菌的基因復(fù)制和刪除有著極大的潛在影響，IS片段的插入可以導(dǎo)致偽基因的產(chǎn)生，從而“剔除”那些與感染侵襲等因素?zé)o關(guān)的蛋白，達(dá)到適應(yīng)進(jìn)化的目的[9,29]。

3.4prn表達(dá)缺失的分布特點(diǎn) 基因序列顯示，百日咳桿菌prn呈多態(tài)性，包括13個不同基因型，從prn1到prn13。國內(nèi)外用來生產(chǎn)疫苗的菌株表達(dá)prn1或prn7，但大多數(shù)臨床分離株表達(dá)prn2[30-31]。導(dǎo)致Prn表達(dá)缺失的基因突變可在百日咳桿菌各個譜系獨(dú)立產(chǎn)生。在美國，一項對1935—2012年百日咳流行菌株進(jìn)行脈沖場凝膠電泳分型的調(diào)查顯示，與Prn表達(dá)菌株中占領(lǐng)絕對優(yōu)勢的CDC013菌株不同，CDC002和CDC237菌株占據(jù)著Prn缺陷菌株的統(tǒng)治地位，占比達(dá)到55%，CDC013菌株卻只占5%[32-33]；而另一項調(diào)查證明，在日本傳播的Prn缺失株是克隆擴(kuò)增的結(jié)果，與在法國發(fā)現(xiàn)的Prn缺失株的分子機(jī)制有明顯不同[34]。在日本發(fā)現(xiàn)的Prn缺失菌株多為prn1型，法國[34]、美國[33]則多為prn2型。有研究顯示，部分日本Prn缺失株的基因突變類型在世界范圍內(nèi)沒有檢測到近源的祖先菌株，表明這一譜系的Prn缺失菌株僅在日本原發(fā)出現(xiàn)[15,23,34-36]。另外，一些地區(qū)的流行菌株基因型會呈現(xiàn)出與國家流行菌株有所不同的現(xiàn)象，提示不同地區(qū)的百日咳桿菌基因型的變化導(dǎo)致的Prn缺失株具有地區(qū)特異性[36]。這也可能是百日咳疫情在某些地區(qū)出現(xiàn)暴發(fā)的原因。

3.5 Prn缺失株出現(xiàn)的原因 相似的人群選擇壓力，特別是疫苗免疫策略則會使Prn缺陷菌株固定在特定人群中，并造成暴發(fā)和流行。美國、澳大利亞和法國等國的研究發(fā)現(xiàn)，Prn缺失株暴發(fā)流行的現(xiàn)象與普及ACVs接種的時間和所含抗原成分關(guān)系密切(表1)。在澳大利亞的一項研究中，研究者用同等劑量的Prn表達(dá)菌株和Prn缺失株同時感染未免疫和ACVs免疫后的幼年小鼠。在未免疫的小鼠中，Prn表達(dá)菌株占據(jù)了絕對地位，而經(jīng)過ACVs免疫后的小鼠中，Prn缺失株卻占據(jù)了統(tǒng)治地位[37]。根據(jù)歐盟一項比較1998—2012年不同國家臨床分離株的研究，各個采取ACVs免疫策略的國家中，只有丹麥未發(fā)現(xiàn)Prn缺失株。值得注意的是，丹麥的ACVs中僅含有PT一種成分，因此Prn缺失株很可能在這種免疫人群中沒有選擇優(yōu)勢[15]。在日本，Prn缺失株自1997年開始出現(xiàn)，2005—2007年占臨床分離菌株的比例達(dá)到41%，2008—2010年為35%。之后，Prn缺失株所占比例開始逐年下降，2011—2013年為25%，2014—2016年為8%。值得注意的是，自2012年起，日本開始使用不包含Prn的ACVs[38]。根據(jù)美國的一項研究，Prn缺失株與Prn表達(dá)株對于臨床應(yīng)用的抗生素的敏感性沒有顯著差異，因此可以基本排除臨床治療方案對于Prn缺失株產(chǎn)生的影響[39]。所以，Prn缺失株的出現(xiàn)，可能是含有Prn成分的ACVs造成的免疫環(huán)境改變，對菌株產(chǎn)生新的選擇壓力的結(jié)果。

綜上所述，Prn缺失株的流行和暴發(fā)實(shí)際上是菌株自身的變異和宿主人群免疫水平共同作用所產(chǎn)生的自然選擇的結(jié)果[11,40]。

表1 部分國家疫苗接種情況及Prn缺失株的發(fā)現(xiàn)和流行情況

*ACV1=PT； ACV2=PT+FHA； ACV3=PT+FHA+Prn； ACV5=PT+FHA+Prn+FIM2+FIM3；-尚未發(fā)現(xiàn)Prn缺失株； ACV1～5：含1～5種抗原的無細(xì)胞百日咳疫苗； Prn：黏附素蛋白； PT：百日咳毒素； FHA：絲狀血凝素； FIM：菌毛蛋白

3.6 Prn缺失合并其他基因變異株的出現(xiàn) 目前，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并記錄17種由于PT編碼基因的啟動子區(qū)的點(diǎn)突變所導(dǎo)致的百日咳桿菌新的基因型。在對2005—2016年日本流行菌株的研究中，與ptxP3密切相關(guān)的多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)變化分型中的MT27型逐漸處于統(tǒng)治地位，且在其中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Prn缺失株[34,46]。與此同時，在歐盟的一項調(diào)查研究中，也發(fā)現(xiàn)了Prn缺失株同時包括ptxP3基因型。ptxP3譜系于20世紀(jì)80年代后期首次發(fā)現(xiàn)，相較于ptxP1譜系能產(chǎn)生更多PT，并且近十幾年來在使用ACVs的國家中逐漸占據(jù)統(tǒng)治地位[12,15]。因此，這種同時具有ptxP3基因型和Prn缺失現(xiàn)象的菌株，也許會更加適合ACVs免疫背景下的國家和地區(qū)，可能是將來應(yīng)該重點(diǎn)監(jiān)測和研究的菌株。

除此以外，近年的研究報告中，各國學(xué)者們也發(fā)現(xiàn)了PT合并Prn共同缺失的菌株。有研究證明，存在PT缺失的菌株依舊能侵入上皮細(xì)胞造成巨噬細(xì)胞凋亡，并且可產(chǎn)生類百日咳現(xiàn)象。此外，由于目前百日咳血清學(xué)診斷主要是檢測特異的PT抗體，因此含有PT缺失的菌株很容易引起血清學(xué)檢驗的漏報現(xiàn)象，為臨床確診工作帶來麻煩[8,26,35]。所以這種Prn缺失合并其他基因變異的菌株也應(yīng)該在未來引起人們的關(guān)注和重視。

4 結(jié) 語

相對于WCVs接種后誘導(dǎo)的廣泛免疫應(yīng)答，ACVs接種后僅誘導(dǎo)單抗原免疫作用增加。而Prn缺失株的特點(diǎn)使其更容易逃避宿主免疫，擁有巨大的自然選擇優(yōu)勢，因此這種菌株的流行大大降低了ACVs的疫苗效力，造成的百日咳流行和暴發(fā)也成為了ACVs時期被廣泛關(guān)注的問題。國際上還沒有建立Prn缺失株的標(biāo)準(zhǔn)菌株，因此對這一領(lǐng)域的探究還有極大的發(fā)展空間[26,36]。我國正處于ACVs廣泛應(yīng)用的初期，面對Prn缺失株為代表的ACVs抗原缺失菌株帶來的挑戰(zhàn)，必須保持足夠的警惕。盡管目前國際上對于Prn缺失株的解決辦法還不是很多，但是加強(qiáng)流行菌株的監(jiān)測，建立更加完備的百日咳診斷體系，完善疫苗制作方式，更新疫苗菌株，以及繼續(xù)提升疫苗覆蓋率等舉措，是目前國際上達(dá)成共識的應(yīng)對措施和有效辦法。