飼料微生物添加劑
——地衣芽孢桿菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證初探

■張 明 董 玲

（1.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，遼寧沈陽(yáng)110016；2.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機(jī)械研究所有限公司，遼寧沈陽(yáng)110036）

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是一種在土壤中常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性嗜熱細(xì)菌，細(xì)胞形態(tài)和排列呈桿狀、單生，在惡劣的環(huán)境中以孢子形式存在[1-6]，研究表明地衣芽孢桿菌可促使機(jī)體產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)、殺滅致病菌[7]，達(dá)到調(diào)整菌群、治療目的[8-9]，因此被作為益生菌廣泛應(yīng)用在醫(yī)療領(lǐng)域。近年來(lái)，地衣芽孢桿菌作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用在飼料中，如卜祥斌等[10]與周振峰等[11]分別在肉雞與奶牛飼料中應(yīng)用了地衣芽孢桿菌，獲得了較好的臨床效果。研究表明飼用地衣芽孢桿菌具有拮抗腸道病原細(xì)菌，維護(hù)和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡的作用，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的抗病力和免疫力，可有效的提高飼料的轉(zhuǎn)化率，增加畜禽產(chǎn)品的生產(chǎn)量，可作為抗生素的替代產(chǎn)品[12]。2013年地衣芽孢桿菌被列入到飼料添加劑菌種目錄中，是目前市售較集中的飼料中微生態(tài)制劑產(chǎn)品之一。

近年來(lái)，飼用地衣芽孢桿菌產(chǎn)品的市場(chǎng)占有率逐年上升，但仍處于起步階段，該類產(chǎn)品仍存在質(zhì)量不穩(wěn)定，缺乏完整的產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)等問(wèn)題[13]。因此，飼料產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展飼料中地衣芽孢桿菌的質(zhì)量檢驗(yàn)已成為市場(chǎng)的迫切要求。

隨著分析技術(shù)的快速發(fā)展，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的更新逐步加快，由原來(lái)的十幾年縮短到如今的一年或兩年，如飼料質(zhì)量檢測(cè)方面，2017年一年就連續(xù)頒布幾十個(gè)新標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)更新越快就越需要檢測(cè)人員不斷提高專業(yè)水平，才能實(shí)現(xiàn)新技術(shù)新方法的準(zhǔn)確應(yīng)用。ISO17025《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》中要求實(shí)驗(yàn)室對(duì)新技術(shù)、新方法進(jìn)行驗(yàn)證。目前，對(duì)于微生物檢測(cè)領(lǐng)域的方法驗(yàn)證報(bào)道多集中在藥品的無(wú)菌檢驗(yàn)和微生物限度檢查。本文對(duì)NY/T 1461—2007[14]《飼料微生物添加劑地衣芽孢桿菌》進(jìn)行驗(yàn)證，文中詳細(xì)闡述了地衣芽孢桿菌檢測(cè)的要點(diǎn)、相關(guān)參數(shù)的考核以及各方面的注意事項(xiàng)，期望對(duì)飼料檢測(cè)機(jī)構(gòu)開展新方法驗(yàn)證提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

質(zhì)控菌株為地衣芽孢桿菌ATCC 6634，購(gòu)自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 產(chǎn)品來(lái)源

混合型飼料添加劑地衣芽胞桿菌由飼料添加劑生產(chǎn)企業(yè)提供。

1.3 儀器

生物安全柜CLASS Ⅱ（美國(guó)NUAIRE公司）；全自動(dòng)高壓滅菌器（日本三洋電器集團(tuán)）；恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)BINDER 公司）；VITEK 細(xì)菌鑒定儀（BIOMERIEUX 公司）；AL 104-IC電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司）。

1.4 培養(yǎng)基與材料

滅菌生理鹽水、桑塔斯瓊脂、革蘭氏染色套裝購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司、青島海博有限公司、北京三藥有限公司；BCL鑒定卡購(gòu)自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

2 活菌數(shù)測(cè)定方法主要參數(shù)的確定

2.1 供試液的制備

稱取地衣芽孢桿菌樣品25.0 g，置于含225 ml 0.85%滅菌生理鹽水的錐形瓶中，添加20顆直徑4 mm的無(wú)菌玻璃珠，置振蕩器中，160 r/min振搖20 min，充分混勻制成1∶10 供試液。根據(jù)地衣芽孢桿菌樣品的理論活菌含量，為了實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性，使最終每塊平皿菌落數(shù)為30～300 CFU 每平皿，采取以下步驟稀釋：取1∶10 供試液1 ml，加稀釋液9 ml，制成1∶100供試液，之后按10倍梯度關(guān)系稀釋，每次稀釋時(shí)振搖60 s，稀釋至制成不同濃度稀釋液。

2.2 傾注法培養(yǎng)

選取3 個(gè)適宜的稀釋度，每個(gè)稀釋度做3 次重復(fù)。將1 ml供試液置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，使用融化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（50 ℃），向每個(gè)培養(yǎng)皿傾倒約12 ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，于(36±1)℃倒置培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2.3 培養(yǎng)溫度的考察

由于標(biāo)準(zhǔn)中未給出傾注法具體培養(yǎng)溫度，需要對(duì)培養(yǎng)的溫度進(jìn)行考察。取地衣芽胞桿菌樣品按2.1節(jié)和2.2 節(jié)方法操作，同法制備3 組分別置30、36 ℃和40 ℃培養(yǎng)，于24 h分別觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算不同培養(yǎng)溫度的活菌數(shù)。培養(yǎng)結(jié)果如圖1 所示，30 ℃培養(yǎng)時(shí)，菌落較小，不宜計(jì)數(shù)，且活菌數(shù)與其他溫度測(cè)定結(jié)果有顯著差異；36 ℃培養(yǎng)所得菌落大小適宜，容易計(jì)數(shù)，可作為參照溫度；40 ℃培養(yǎng)時(shí)，在16 h 菌落就已經(jīng)過(guò)大，不適宜計(jì)數(shù)。因此，通過(guò)考察，推薦地衣芽孢桿菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)溫度為36 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

圖1 不同溫度下地衣芽孢桿菌的形態(tài)圖

2.4 培養(yǎng)基來(lái)源的考察

采用3個(gè)不同廠家的營(yíng)養(yǎng)瓊脂實(shí)驗(yàn)，取地衣芽胞桿菌樣品3 個(gè)按2.1 節(jié)和2.2 節(jié)方法操作進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定比較。結(jié)果表明采用3 個(gè)廠家營(yíng)養(yǎng)瓊脂實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果之間無(wú)顯著性差異，表明上述3種培養(yǎng)基對(duì)于地衣芽孢桿菌的促生長(zhǎng)能力相當(dāng)。

3 活菌數(shù)測(cè)定方法的驗(yàn)證

3.1 菌落特性檢驗(yàn)

分別將樣品稀釋液劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂、桑塔斯瓊脂、牛肉浸汁培養(yǎng)基中于30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落特征。菌落特征分別為“杏仁白色、濕潤(rùn)光澤”，“乳脂色、濕潤(rùn)光澤、不透明”和“乳脂色、濕潤(rùn)光澤、不透明”，符合NY/T 1461—2007規(guī)定的菌落特性。

表1 不同來(lái)源培養(yǎng)基對(duì)地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響(CFU/g)

3.2 革蘭氏染色檢驗(yàn)

使用革蘭氏染色套裝，按說(shuō)明書進(jìn)行染色，于生物顯微鏡（100倍油鏡）中觀察。革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性。結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.3 生化鑒定

使用BCL鑒定卡，對(duì)試驗(yàn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為地衣芽孢桿菌，證明鑒定方法的準(zhǔn)確性，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 地衣芽孢桿菌革蘭氏染色結(jié)果

表2 地衣芽孢桿菌生化鑒定結(jié)果

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

按NY/T 1461—2007 檢測(cè)方法對(duì)同一樣品進(jìn)行多次測(cè)定，RD在0～21%，RSD為19.2%，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

3.5 中間精密度試驗(yàn)

不同人員按NY/T 1461—2007 檢測(cè)方法對(duì)同一樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果分別為3.2×1010CFU/g 和4.2×1010CFU/g，相對(duì)偏差為13.5%。

4 討論

微生物檢測(cè)方法確認(rèn)首先應(yīng)明確檢測(cè)對(duì)象特定的需求包括樣品的特征，數(shù)量，并應(yīng)滿足客戶的特殊需要，同時(shí)應(yīng)根據(jù)方法的預(yù)期用途，選擇需要確認(rèn)的方法特性參數(shù)。通常應(yīng)對(duì)方法的準(zhǔn)確度、包容性和排他性等進(jìn)行確認(rèn)。本試驗(yàn)的驗(yàn)證對(duì)象為地衣芽孢桿菌，因此對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)中的生化反應(yīng)、菌落特征進(jìn)行確認(rèn)，明確地衣芽胞桿菌的生化特性和菌落形態(tài)，為活菌計(jì)數(shù)提供輔助測(cè)定，在活菌計(jì)數(shù)時(shí)必做項(xiàng)目為準(zhǔn)確度和中間精密度實(shí)驗(yàn)。

5 結(jié)論

方法驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室開展新方法的前提和基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行地衣芽孢桿菌檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證中明確了NY/T 1461—2007 具體操作流程和注意事項(xiàng)。主要有以下幾個(gè)方面：

①地衣芽孢桿菌對(duì)酸性環(huán)境比較敏感，因此在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)確保滅菌后培養(yǎng)基的pH 值為7 左右，以避免抑制地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)；

②樣品的前處理包括稀釋對(duì)于準(zhǔn)確測(cè)定活菌數(shù)至關(guān)重要，需考慮樣品處理方法、樣品振蕩時(shí)間、振蕩頻率，制備供試液時(shí)可添加適量的無(wú)菌玻璃珠；

③培養(yǎng)溫度是微生物檢測(cè)的關(guān)鍵因素，直接影響菌落的生長(zhǎng)情況，進(jìn)而影響到計(jì)數(shù)結(jié)果；

④防止芽孢桿菌污染的措施。芽孢桿菌中由于含有孢子，極易擴(kuò)散，且難以除去，很容易對(duì)樣品和實(shí)驗(yàn)環(huán)境造成污染，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。