不同生育期飼料油菜體外發(fā)酵特性的研究

■王洪超 穆春玲 劉大森 辛杭書 李忠秋 劉春龍

（1.中國科學院東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江哈爾濱150081；2.琿春市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，吉林琿春133300；3.琿春市英安鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，吉林琿春133300；4.東北農業(yè)大學動物科技學院，黑龍江哈爾濱150030；5.黑龍江省農業(yè)科學院畜牧研究所，黑龍江哈爾濱150086）

體外發(fā)酵技術是模擬瘤胃液對飼料進行體外發(fā)酵培養(yǎng)，體外培養(yǎng)環(huán)境接近瘤胃內發(fā)酵環(huán)境。運用此方法的最大優(yōu)點就是不受試驗動物的條件限制，可以很容易的在常規(guī)實驗室條件下進行，因此得到了廣泛的應用。油菜含有雙高既高芥酸和高硫代葡萄糖甙這兩種物質，導致其含有辛辣味而且如果畜禽過量采食，會引起新陳代謝紊亂引發(fā)甲狀腺腫大。甚者導致家畜死亡[1]。經過研究，傳統(tǒng)油菜改良成含有低芥酸、低硫代葡萄糖甙的油飼兼用品種，又名飼料油菜。飼料油菜具有生長快、產量高的特點，平均鮮草產量為49 747.5 kg/hm2，最高可達74 550 kg/hm2[2]，飼用增重效果明顯[3]。其蛋白含量為25.6%，粗脂肪2.4%[4]，營養(yǎng)價值很高?？梢宰鳛閮?yōu)質的青粗飼料[5]。飼料油菜的耐寒性很強[6]，易于推廣，在晚秋種植，既能延長青綠飼料供給期還能解決牧草生產的季節(jié)性與家畜對營養(yǎng)需求的相對均勻性之間存在的供求矛盾[7]。前期試驗得到飼料油菜的不同生育時期營養(yǎng)成份，見表1。本試驗在前期試驗基礎上，研究不同生育期飼料油菜的體外發(fā)酵特性，旨在為生產中飼料油菜合理的利用提供參考數(shù)據(jù)。

表1 不同生育期的飼料油菜常規(guī)營養(yǎng)成分（%，絕干基礎）

1 材料與方法

1.1 試驗基地情況

本試驗的種子由華中農業(yè)大學提供，為“華油雜62”。種植地位于黑龍江省海倫市（45°58′～47°52′N，126°14′～127°45′E），最高氣溫達37.7 ℃，最低氣溫達-40.3 ℃，平均氣溫在2 ℃左右。年均降水量為500～600 mm，主要集中在5～9月份。無霜期在120 d左右，終霜期多在5月中下旬開始。年日照達2 600～2 800 h。

1.2 試驗樣品準備

飼料油菜分別在現(xiàn)蕾期、盛花期和結莢期進行采集，保證全株距離地面3 cm 刈割。在保證飼料油菜全株的情況下，每個生育期樣品分別隨機選取3 個代表性樣方。樣品在105 ℃、15 min 的烘箱內進行殺青處理，接著進行風干樣制備，條件控制在65 ℃、48 h。最后樣品進行粉碎過1 mm 篩，密封袋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗動物條件

試驗選用3 頭體重在(500±50)kg 的中國荷斯坦奶牛，年齡在3.5 歲并裝有永久性瘤胃瘺管。在東北農業(yè)大學阿城試驗基地（45°31′N、127°02′E）實驗室內進行體外發(fā)酵試驗。試驗牛飼養(yǎng)按1.3 倍維持水平，日糧精粗比為45∶55。日糧主要成分見表2。保證自由飲水，早6:00和晚18:00飼喂。

1.4 瘤胃液采集

瘤胃液采集工作在早6：00 飼喂結束后開始，保證采集是在瘤胃內的5個不同位點，并將采集到的瘤胃液迅速裝入保溫瓶內，蓋好瓶蓋備用。保溫瓶應事先39 ℃預熱并通入二氧化碳（C02）置換出瓶內的空氣。最后將采集到的瘤胃液充分混合后經4 層紗布過濾處理。

表2 基礎日糧配方及營養(yǎng)水平（風干基礎）

1.5 體外發(fā)酵液的配制

1.5.1 緩沖液的配制

體外發(fā)酵的培養(yǎng)基按照Menke 等[8]的方法配制，緩沖液需要微量元素A 液、緩沖液B 液、常量元素C液、刃天青溶液D液、還原劑溶液E液，各溶液配方如表3所示。

表3 緩沖液各溶液的配方

1.5.2 人工瘤胃微生物營養(yǎng)培養(yǎng)液的配制

人工瘤胃微生物營養(yǎng)培養(yǎng)液需現(xiàn)用現(xiàn)配，按照下列比例和順序配制人工瘤胃微生物營養(yǎng)培養(yǎng)液：蒸餾水400 ml+A 液0.1 ml+B 液200 ml+C 液200 ml+刃天青溶液1 ml+還原劑溶液40 ml。當加入刃天青溶液后混合液變?yōu)榧t色，馬上將配制好的培養(yǎng)液里通入CO2氣體并預熱至39 ℃，持續(xù)時間約30 min 后，培養(yǎng)液顏色變淡至無色。

1.5.3 混合培養(yǎng)液的配制

將過濾處理的瘤胃液和人工瘤胃微生物營養(yǎng)培養(yǎng)液按1∶2的比例混合，配制足量的混合培養(yǎng)液，此混合培養(yǎng)液接近瘤胃內發(fā)酵環(huán)境。

1.6 試驗發(fā)生配制和體外發(fā)酵裝置

由恒溫水浴搖床和培養(yǎng)單位裝置構成體外發(fā)酵裝置。恒溫水浴搖床的工作條件為39 ℃；培養(yǎng)單位是帶有100 ml刻度的玻璃注射器，并在注射器活塞管上涂抹少量石蠟的方法，來防止漏氣和減少阻力。

本試驗選用現(xiàn)蕾期、盛花期和結莢期的飼料油菜為3個試驗樣，在每個注射器內分別放入200 mg試驗樣，并用注射器準確吸取30 ml 的混合培養(yǎng)液。同時設置空白對照組作為氣體校正。將封閉好的發(fā)酵注射器全部轉入39 ℃恒溫搖床進行體外發(fā)酵。

1.7 測定指標和方法

分別在2、4、8、12、24、36、48 h 和72 h 進行產氣量的測定；在4、12、24、48 h和72 h后取出各組發(fā)酵培養(yǎng)液，冷凍保存用于測定NH3-N 含量和VFA 的各組分含量。其中產氣量由刻度注射器直接讀出。產氣量利用SAS9.1 程序，根據(jù)?rskov 和McDonald 的產氣模型公式將各組樣品在2、4、8、12、24、36、48 h和72 h時間點的產氣量代入，計算消化動力參數(shù)。NH3-N通過標準曲線繪制來測定。VFA通過氣象色譜測定。

1.8 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003 整理數(shù)據(jù)和結果換算。用SAS9.1版軟件進行方差統(tǒng)計分析，均值多重比較采用Duncan's法，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 不同生育期飼料油菜對體外發(fā)酵產氣量的影響

如表4 所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，不同生育期飼料油菜體外發(fā)酵累計產氣量呈遞增趨勢；培養(yǎng)48 h以前的階段，氣體增加較快，之后產氣量變化較平緩，但結莢期在最后的48～72 h產氣量增加波動較大。其中現(xiàn)蕾期和盛花期在整個發(fā)酵過程中產氣曲線趨勢基本吻合。72 h 的累計產氣量表現(xiàn)為現(xiàn)蕾期顯著高于盛花期和結莢期（P＜0.05），盛花期高于結莢期，但差異不顯著（P＞0.05）。隨著飼料油菜生育期的增長，理論最大產氣量有遞減的趨勢，但各組之間差異不顯著（P＞0.05），這與李富娟等[9]研究結果一致。產氣速度有隨著生育期的增長而增大的趨勢（P＞0.05）。結莢期的產氣延滯期顯著低于盛花期（P＞0.05）和現(xiàn)蕾期（P＜0.05）。

表4 不同生育期飼料油菜對體外產氣量及產氣參數(shù)的影響

2.2 不同生育期飼料油菜對體外發(fā)酵NH3-N含量的影響

表5 不同生育期飼料油菜體外培養(yǎng)對NH3-N含量影響(mg/dl)

由表5可知，各組培養(yǎng)液NH3-N濃度隨著體外培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加。在12～48 h 內，各生育期體外發(fā)酵產生的NH3-N增加顯著，其中盛花期NH3-N濃度最高。在培養(yǎng)24 h時，NH3-N濃度由高到低依次是盛花期、現(xiàn)蕾期、結莢期（P＜0.05）。48 h以后，NH3-N 濃度增加緩慢。在72 h 時盛花期NH3-N 濃度顯著高于結莢期（P＜0.05），高出3.25 mg/dl。

2.3 不同生育期飼料油菜對體外發(fā)酵VFA 含量的影響

如表6 所示，體外培養(yǎng)72 h 后，不同生育期的各VFA 含量變化規(guī)律相似，在4～12 h 呈升高趨勢，12～24 h有所下降，24 h～48 h逐漸回升。在4 h時間點，現(xiàn)蕾期的乙酸濃度顯著高于盛花期（P＞0.05）和結莢期（P＜0.05），但盛花期和結莢期差異不顯著（P＞0.05），12 h以后，不同生育期的乙酸濃度差異不顯著（P＞0.05）；在12、24 h和72 h時間點，盛花期丙酸和丁酸濃度最低，但差異不顯著（P＞0.05）；乙酸與丙酸比值的結果表明，4 h時間點現(xiàn)蕾期顯高于結莢期（P＜0.05），但不顯著高于盛花期（P＞0.05），在72 h時間點，盛花期顯高于結莢期（P＜0.05），但不顯著高于現(xiàn)蕾期（P＞0.05）。

表6 不同生育期飼料油菜對瘤胃體外發(fā)酵VFA含量的影響

3 討論

3.1 不同生育期飼料油菜對體外發(fā)酵產氣量的影響

在一定時間內，體外發(fā)酵累計產氣量的多少可以反映出發(fā)酵底物中碳水化合物被瘤胃微生物利用的程度，同時發(fā)酵底物營養(yǎng)價值的高低也影響產氣量。目前預測干物質降解率的最主要指標是體外發(fā)酵產氣方法[10]。Clark 等[11]指出有機物含量越多會影響瘤胃內微生物活性，從而使產氣量多，換言之，飼糧中可發(fā)酵的有機物含量和產氣量之間存在正相關。本試驗結果表明，隨著飼料油菜生育期的延長，其體外發(fā)酵產氣量逐漸下降，這可能是植物的次生細胞壁中不易降解的纖維素和木質素多的原因。隨著植物的生長越來越成熟，植物細胞壁成分會由易溶性的初生細胞壁成分轉化為不易溶的成熟次生細胞壁[12]。飼料油菜的結莢期含有較高的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和木質素。試驗結果可以看出體外發(fā)酵累計總產氣量與CP 含量呈正相關，與ADF、NDF 含量呈負相關。這與湯少勛等[13]和Nsahlai等[14]研究結果一致。

3.2 不同生育期飼料油菜對體外發(fā)酵NH3-N含量的影響

瘤胃的氮代謝受瘤胃液中NH3-N 濃度的影響，NH3-N 濃度主要受來自瘤胃微生物對氮利用速度和飼料含氮物質在瘤胃降解速率間動態(tài)平衡的影響，NH3-N 濃度的高低可反映出瘤胃微生物生成菌體蛋白和飼料日糧中蛋白質降解的情況[15]，在特定日糧組成模式下，NH3-N濃度一定程度上反映了蛋白質合成與分解間達到的平衡狀態(tài)[16]。體外發(fā)酵底物中蛋白質的含量、理化特性和降解速率以及發(fā)酵底物含氮物和能量載體物的比例等都會影響體外發(fā)酵體系中NH3-N濃度，特別是微生物菌體蛋白的合成速率與微生物降解的影響[17]。在一般情況下，都會產生氮的損失和飼料蛋白質的浪費，因為氨的產生速率遠超過微生物對他的利用的速率，過量的氨以尿素形式排出體外。本試驗NH3-N 濃度在瘤胃微生物生長所需最佳NH3-N 濃度5～28 mg/dl[18]的范圍內。試驗表明，NH3-N濃度隨著體外培養(yǎng)時間的延長，各生育期飼料油菜的累計NH3-N 產量逐漸提高，在48 h 以后，NH3-N 產生速率開始降低，這與程茂基[19]研究結果一致。由于體外發(fā)酵底物只有牧草，能量供應不足，瘤胃內微生物在利用氨合成蛋白質的過程無法獲得充足能量，導致NH3-N 的積累增加[20]。72 h NH3-N 濃度表現(xiàn)為盛花期顯著高于現(xiàn)蕾期和結莢期（P＜0.05）。隨著生育期的增長，NH3-N 呈降低趨勢，與余苗[21]試驗結果一致；整個過程，NH3-N 與CP 有正相關關系，與ADF 和NDF有負相關關系，這與Cone等[22]、甘潔[23]和余苗等[24]的研究結果相符。原因可能是，可利用粗蛋白的含量會隨著植物生育期的增長而減少，相反細胞壁中的半纖維素、纖維素以及木質素等不可利用部分含量增加，引起消化率下降。飼料蛋白的降解是瘤胃內大部分NH3-N的直接來源，通過測定瘤胃內NH3-N濃度可反映出牧草中蛋白的瘤胃降解特性。NH3-N濃度高低，可以得出蛋白質降解的多少，因此NH3-N濃度含量是評價飼料品質的主要指標之一。本試驗結果可以看出結莢期飼料油菜沒有現(xiàn)蕾期和盛花期飼料油菜理想。

3.3 不同生育期飼料油菜對體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

揮發(fā)性脂肪酸（VFA）是能量代謝的主要能量來源，反芻動物瘤胃中的碳水化合物經微生物作用發(fā)酵所產生的VFA 主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸等，其中前三種酸占能源物質的80%。反芻動物乳脂合成的主要前體物質是乙酸[25]，葡萄糖合成的主要底物是丙酸，乙酸/丙酸可以間接反映能量利用率的情況。飼草中的不可利用部分，比如半纖維素、纖維素和木質素的含量，會影響瘤胃發(fā)酵產生乙酸的含量[21]，而纖維素的降解率對乙酸含量的影響更大[26]。本降解試驗得出盛花期的NDF有效降解率和NDF快速降解部分大于其他時期，所以72 h發(fā)酵試驗得出盛花期的乙酸濃度最高（P＞0.05）。乙酸/丙酸的值在3以下屬于丙酸型發(fā)酵，而在3 以上為乙酸型發(fā)酵。本試驗不同生育期的各時間點乙酸比丙酸的值都大于3。結果說明，飼料油菜的不同生育期發(fā)酵類型均趨于乙酸類型。Slianikove 等[27]研究表明單寧可抑制微生物活性，試驗發(fā)酵72 h以后，盛花期的乙酸/丙酸比值顯著高于結莢期（P＜0.05），可能是盛花期飼料油菜單寧含量較低的原因，對瘤胃微生物的某些菌群的抑制作用較弱，這與李占明等[28]和馬敏等[29]研究規(guī)律一致。Wang 等[30]和Ngamsaeng 等[31]研究表明單寧含量對乙酸/丙酸存在影響。

4 結論

隨著體外發(fā)酵時間的延長，最大產氣量逐漸降低，表現(xiàn)出現(xiàn)蕾期最高，結莢期最低；發(fā)酵72 h，盛花期的NH3-N濃度、乙酸濃度和乙酸/丙酸濃度最高，結莢期最低。盛花期的飼料油菜發(fā)酵效果較好。