體外法估測(cè)日糧和飼料原料外源代謝葡萄糖值

■李 強(qiáng) 呂良康 熊 奕 張 慧 方 勇 馮 志 任 瑩 趙勝軍，2*

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.湖北省飼料工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430023）

葡萄糖是唯一一種能通過(guò)血漿和細(xì)胞在全身循環(huán)的單糖，是生命活動(dòng)所需能量的重要來(lái)源[1]。葡萄糖的吸收和利用在動(dòng)物能量代謝中居于中心地位，如參與神經(jīng)調(diào)節(jié)、機(jī)體活動(dòng)等的各種代謝[2-3]。動(dòng)物機(jī)體內(nèi)葡萄糖主要包括兩種來(lái)源：外源葡萄糖和內(nèi)源葡萄糖。外源葡萄糖指的是飼料內(nèi)的可溶性糖和淀粉在消化道前段經(jīng)過(guò)消化酶作用形成葡萄糖并由消化道吸收的部分[4]。而內(nèi)源葡萄糖為腸前段未被消化吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由腸道微生物發(fā)酵分解，生成揮發(fā)性脂肪酸，通過(guò)腸壁擴(kuò)散進(jìn)入體內(nèi)，由非糖物質(zhì)（如乳酸、乙酸、丙酸等）在肝臟經(jīng)糖異生作用轉(zhuǎn)化為葡萄糖的部分[5]。

根據(jù)前期研究基礎(chǔ)，方勇通過(guò)在豬回腸末端手術(shù)安裝“T”型瘺管，測(cè)定出日糧外源MG的含量[6]。了解到日糧中所含外源葡萄糖含量測(cè)定的關(guān)鍵在于確定淀粉在小腸內(nèi)的消化率[7]。但運(yùn)用體外法測(cè)定外源葡萄糖就無(wú)需復(fù)雜的手術(shù)或屠宰取樣，更具便捷性。同時(shí)還能完善體內(nèi)法難以測(cè)定某單一飼料原料消化率的缺陷，可用于飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)定。

本研究通過(guò)與體內(nèi)法測(cè)得的4種仔豬常用日糧的MG值相關(guān)性分析，擬確定最為合適條件的體外模擬消化法，隨之運(yùn)用方法測(cè)定幾種常用仔豬飼料外源MG的含量，為建立以仔豬MG為營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)的飼料評(píng)定新體系和葡萄糖營(yíng)養(yǎng)調(diào)控技術(shù)的可行實(shí)用化奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)于體外酶促消化反應(yīng)，溫度、pH值和消化時(shí)間之間幾乎無(wú)交互關(guān)系[8]，且Wilfart 等[9]研究顯示，豬采食后食糜平均1 h 到達(dá)十二指腸近端，從十二指腸近端到回腸遠(yuǎn)端平均時(shí)間為4 h。因此為探尋最佳體外模擬消化條件，設(shè)計(jì)消化時(shí)間為單因素處理，分為1、2、4、6 h和8 h共5個(gè)處理，通過(guò)“胃蛋白酶-胰蛋白酶兩段法”對(duì)四種日糧進(jìn)行體外模擬消化。并逐一將各個(gè)處理組的降解率與通過(guò)體內(nèi)法測(cè)得的日糧淀粉消化率進(jìn)行相關(guān)性分析對(duì)照，以?xún)烧呦嚓P(guān)性最好的處理組時(shí)間作為體外法測(cè)定外源MG的最優(yōu)時(shí)間。

根據(jù)已確定的最優(yōu)體外模擬消化時(shí)間和其它試驗(yàn)條件，測(cè)定六種常見(jiàn)飼料原料的MG值。

1.2 試驗(yàn)日糧

六種常用飼料原料：玉米（新疆）、玉米（吉林）、二等小麥（荊門(mén)）、麥麩（周口）、豆粕（46%，江蘇）、豆粕（43%，武漢）。

4 種試驗(yàn)日糧參照NRC（2012）飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，同時(shí)按照千分之一比例添加TiO2作為外源指示劑，其中日糧Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ淀粉水平分別為25.81%、31.73%、45.71%、49.06%。其具體組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 主要試劑、器材

胃蛋白酶（阿拉丁，P110928），胰蛋白酶（阿拉丁，P110505），100 ml三角瓶，恒溫?fù)u床（上海知楚儀器有限公司，ZHSY-50）。

1.4 操作方法

1.4.1 消化液的配制

①擬胃液溶液：量取8.3 ml 濃鹽酸，同時(shí)稱(chēng)取3.159 g NaCl 置1 000 ml 容量瓶中，加適量蒸餾水溶解稀釋置刻度，搖勻備用。

②2 mol/l NaOH溶液：稱(chēng)取氫氧化鈉固體80 g，加適量蒸餾水稀釋?zhuān)⑥D(zhuǎn)移至1 000 ml容量瓶，定容備用。

③0.1 mol/l磷酸緩沖液：量取0.2 mol/l 磷酸二氫鉀溶液250 ml 至1 000 ml 容量瓶，后添加0.2 mol/l NaOH 溶液118 ml，加適量蒸餾水稀釋定容（含0.05%迭氮鈉）。

表1 日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平

1.4.2 體外消化方法

本研究在已建立的體外消化試驗(yàn)[8，10-15]基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮驮囼?yàn)條件做出適當(dāng)調(diào)整，具體方法如下：

①模擬胃消化階段

粉碎已烘干飼料樣至過(guò)100目篩，稱(chēng)取5 g（精確至0.000 1 g）于三角瓶中，分別加入胃蛋白酶500 mg，擬胃液溶液50 ml，以及0.5%氯霉素溶液[10]（細(xì)菌生長(zhǎng)抑制劑）0.5 ml，后于恒溫?fù)u床上消化1 h（40 ℃，120 r/min）。

②模擬小腸消化階段

模擬胃消化1 h 后，向三角瓶中繼續(xù)加入2 mol/l氫氧化鈉溶液2.5 ml，調(diào)節(jié)pH 值至中性，再加入磷酸緩沖液20 ml 和50 mg 胰蛋白酶，后于恒溫?fù)u床中消化1、2、4、6 h和8 h（40 ℃，120 r/min）。

③消化殘?jiān)氖占?/p>

待模擬小腸消化階段結(jié)束后，取出三角瓶，并用冰水多次沖洗瓶外壁，以使酶活反應(yīng)降至最低甚至完全抑制。取得消化后的濾渣，用已知質(zhì)量的紗布包裹濾渣放入烘箱（105 ℃，8 h），后稱(chēng)重記錄。

1.5 測(cè)定指標(biāo)和方法

根據(jù)雷龍等[16]（2017）的酶解法，來(lái)測(cè)定體外模擬消化所得殘?jiān)牡矸酆俊?/p>

1.6 體外法淀粉降解率計(jì)算公式

P（%）=[(m1-m2)/m1]×100

式中：P——淀粉的體外降解率(%)；

m1——樣品中淀粉量(g)；

m2——消化后殘?jiān)械矸哿?g)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行初步整理，用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，采用Duncan's多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 消化時(shí)間對(duì)日糧淀粉體外降解率的影響

表2 體外消化時(shí)間對(duì)日糧淀粉降解率的影響(%)

四種日糧淀粉體外降解率見(jiàn)表2，圖1?？梢钥闯觯谙瘯r(shí)間1 h 到6 h，四種日糧淀粉降解率都隨時(shí)間延長(zhǎng)而呈顯著提高（P＜0.05），但在消化6 h 后漲幅變慢，表現(xiàn)為6 h 與8 h 的淀粉降解率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖1 體外消化時(shí)間對(duì)日糧淀粉降解率的影響

2.2 體外淀粉降解與體內(nèi)淀粉消化的相關(guān)性分析

根據(jù)方勇的體內(nèi)法測(cè)得的淀粉消化率值，都高于本研究測(cè)得的日糧淀粉降解率[6]，將體外法各處理組值分別與其進(jìn)行相關(guān)性分析對(duì)照，相關(guān)系數(shù)都大于0.900 0，其中體外消化6 h 的相關(guān)系數(shù)較高。如圖2所示，體外消化6 h的測(cè)定結(jié)果為自變量，以體內(nèi)法測(cè)定結(jié)果為因變量，回歸方程為y=0.137 4x+84.834（R2=0.871 1），r=0.933 3。因此進(jìn)行體外模擬消化測(cè)定淀粉消化率的最優(yōu)時(shí)間確定為6 h。

2.3 六種常用飼料原料的淀粉體外降解率及外源MG值

將回歸方程（y=0.137 4x+84.834）與外源MG 的公式整合，即可得到體外法測(cè)定日糧外源MG的估算公式：

外源MG值（g/kg）=小腸淀粉量×（0.14×體外法測(cè)的小腸淀粉消化率+84.83）/0.9

式中：0.9為葡萄糖和淀粉的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

運(yùn)用上述方法和公式，評(píng)定了六種常用飼料原料，其結(jié)果如表3。

圖2 體外消化6 h測(cè)定淀粉降解率與體內(nèi)法淀粉消化率的回歸關(guān)系

表3 六種常用飼料原料淀粉體外降解率及外源MG值

3 討論

外源MG 主要是指淀粉在腸道前段經(jīng)一系列的作用后被小腸所吸收的葡萄糖，所以小腸的淀粉消化率是影響外源MG 的主要因素。體內(nèi)法測(cè)定小腸淀粉消化率需要分別測(cè)定日糧和食糜中的脂肪含量[7，17-18]，則需進(jìn)行動(dòng)物屠宰試驗(yàn)或者通過(guò)手術(shù)安裝“T”型瘺管，試驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜且不能夠測(cè)定某單一飼料原料的消化率。

在“胃蛋白酶-胰蛋白酶兩段法”的體外模擬消化法中，消化的時(shí)間長(zhǎng)短可影響消化的速率以及消化程度。本研究中，在消化時(shí)間1 h 到6 h，四種日糧淀粉降解率都隨時(shí)間延長(zhǎng)而呈顯著提高的趨勢(shì)（P＜0.05），6 h后的降解速率減緩，消化6 h與8 h的淀粉降解率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。體外法測(cè)定的日糧淀粉降解率與體內(nèi)模擬消化法測(cè)得的淀粉消化率相比較低，對(duì)兩者進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)分析，在體外模擬消化6 h 時(shí)與體內(nèi)消化有較高的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)（r=0.933 3）。本試驗(yàn)與現(xiàn)有的研究結(jié)果相同[19-21]。因此，體外模擬消化試驗(yàn)的最佳時(shí)長(zhǎng)為6 h。

“胃蛋白酶-胰蛋白酶兩段法”采用模擬動(dòng)物消化道內(nèi)的兩步酶解對(duì)淀粉進(jìn)行消化的一種體外法，收集模擬消化后的剩余殘?jiān)?，測(cè)定淀粉含量，推算小腸淀粉消化率，本試驗(yàn)方法具有高效、快捷、可重復(fù)等特點(diǎn)，甚至可以測(cè)定單一原料的消化率[6，22]。體外測(cè)定結(jié)果與體內(nèi)試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果有相關(guān)性，對(duì)配方的制作有很大的參考價(jià)值。在體外消化6 h時(shí)與體內(nèi)法相關(guān)性分析結(jié)果得到，兩者相關(guān)系數(shù)r=0.933 3，這與張鐵鷹等（2005）的報(bào)道一致[23]。建立本試驗(yàn)方法后，本試驗(yàn)測(cè)算了6種常用原料淀粉的體外降解率及其外源MG值，為今后各種原料MG 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立奠定基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)豬日糧MG評(píng)價(jià)體系的建立提供可能。

4 小結(jié)

①體外模擬消化法測(cè)定淀粉消化率的最佳消化時(shí)長(zhǎng)為6 h；

②體內(nèi)法測(cè)得的淀粉消化率與體外模擬消化6 h 的淀粉降解率的線(xiàn)性回歸方程為：y=0.137 4x+84.834（R2=0.871 1）。由此推算出飼料外源MG 的體外法估算公式為：外源MG=（0.14×體外法測(cè)的小腸淀粉消化率+84.83）/0.9×小腸淀粉量;

③6 種豬料原料的外源MG 的含量為：玉米（吉林）667.41 g/kg、玉米（新疆）741.10 g/kg、麥麩（周口）396.40 g/kg、二等小麥（荊門(mén)）632.22 g/kg、豆粕（43%，武漢）84.11 g/kg、豆粕（46%，江蘇）93.25 g/kg。