甲基綠與吡羅紅染色效果及染色機(jī)理的探析

福建 四川

現(xiàn)行高中生物教材（人教版、浙科版、北師大版、蘇教版）中都介紹了利用甲基綠、吡羅紅（又稱派洛寧、焦寧）混合染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，從而觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布。教材中該染色實(shí)驗(yàn)比較強(qiáng)調(diào)甲基綠、吡羅紅需要先混合再進(jìn)行染色，但在高考試題中還多次考查了甲基綠單獨(dú)染色的實(shí)驗(yàn)效果。為驗(yàn)證甲基綠和吡羅紅單獨(dú)染色、混合染色和分染的實(shí)驗(yàn)效果，筆者嘗試以對(duì)高考試題分析著手，依據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果探討兩種染液的染色機(jī)理和部分高考試題。

1.高考原題再現(xiàn)

【例1】（2012年，江蘇卷，第19題）表1中有關(guān)人體細(xì)胞化合物的各項(xiàng)內(nèi)容，正確的是 （ ）

表1

A.① B.② C.③ D.④

【參考答案】C

【分析】例1的④被排除在正確選項(xiàng)之外，江蘇省考試院給出本題④選項(xiàng)的解析為“核酸包括DNA和RNA，甲基綠染液僅是DNA的染色劑，故D選項(xiàng)錯(cuò)誤”?？梢娫擃}命題者認(rèn)為甲基綠染液僅是DNA（脫氧核糖核酸）的染色劑，不能與RNA（核糖核酸）作用呈現(xiàn)顏色。類似試題還有2009年江蘇卷第21題D選項(xiàng)。

【例2】（2016年，海南卷，第15題節(jié)選）下列實(shí)驗(yàn)中，加入試劑后不能產(chǎn)生特定顏色的是 （ ）

B.黑暗中生長24 h的天竺葵葉片，用碘液檢測(cè)淀粉

C.玉米根尖經(jīng)甲基綠染色后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞核

【參考答案】B

【分析】本題的C選項(xiàng)考查甲基綠單獨(dú)染色效果——在顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞核呈綠色。教育部考試中心給出的C選項(xiàng)的解析為“甲基綠溶于水，顯藍(lán)綠色，為堿性染料，甲基綠與DNA的親和力很強(qiáng)，能使DNA呈現(xiàn)綠色，因此玉米根尖經(jīng)甲基綠染色后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞核被染成綠色”。類似試題還有2014年重慶卷第1題A選項(xiàng)和2008年江蘇卷第4題D選項(xiàng)。

2.甲基綠、吡羅紅單獨(dú)染色實(shí)驗(yàn)效果驗(yàn)證

以洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細(xì)胞為材料，利用0.15%甲基綠單獨(dú)染色時(shí)染色效果如圖1和圖2所示，由圖可知，甲基綠在單獨(dú)染色時(shí)能將細(xì)胞核染成明顯的藍(lán)綠色（圖中深色部分），同時(shí)細(xì)胞質(zhì)部分也呈現(xiàn)淡綠色。本實(shí)驗(yàn)同樣利用了2%吡羅紅對(duì)洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細(xì)胞進(jìn)行染色，染色效果如圖3和圖4所示，發(fā)現(xiàn)吡羅紅在單獨(dú)染色時(shí)能將洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細(xì)胞核染成較深的紫紅色（圖中深色部分），細(xì)胞質(zhì)部分也呈現(xiàn)淡紅色。該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了甲基綠單獨(dú)染色時(shí)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都顯出綠色，吡羅紅單獨(dú)染色時(shí)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都顯出紅色。在顯微鏡下都可以清晰地觀察到細(xì)胞核，例2等相關(guān)選項(xiàng)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

圖1 酸解后，0.15%甲基綠染色效果

圖2 不酸解，0.15%甲基綠染色效果

圖3 酸解后，2%吡羅紅染色效果

圖4 不酸解，2%吡羅紅染色效果

3.甲基綠、吡羅紅混合染色法與分染法實(shí)驗(yàn)效果驗(yàn)證

在“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”的教材實(shí)驗(yàn)中，通常采用甲基綠、吡羅紅混合染色法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但因當(dāng)前市場(chǎng)上沒有甲基綠和吡羅紅的混裝粉出售，故采用的是以下方法配制兩種染液：分別取甲基綠2g溶于98mL蒸餾水中制成2%的甲基綠溶液，取吡羅紅5g溶于95mL蒸餾水中制成5%的吡羅紅溶液，放入棕色瓶中備用。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)成功有幾個(gè)關(guān)鍵影響因素：①染液的pH：pH偏高時(shí)吡羅紅不易著色，pH偏低時(shí)甲基綠不易著色，pH為4.8時(shí)染色效果最好。故實(shí)驗(yàn)中可利用pH為4.8的緩沖液代替蒸餾水沖洗，保證染色時(shí)處于適宜的pH條件下。②甲基紫的影響：甲基綠久置易產(chǎn)生甲基紫，在染色過程中容易使細(xì)胞核偏紫色。因甲基紫溶于氯仿，故可利用氯仿抽提除去甲基紫，排除甲基紫對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。③酸解的影響：鹽酸濃度太高易引起洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的質(zhì)壁分離；解離過度還易使細(xì)胞核偏向藍(lán)紫色，2%的鹽酸解離2min再染色或不解離直接染色效果更好。④材料的新鮮程度：材料不新鮮，其DNA和RNA可能發(fā)生降解，導(dǎo)致細(xì)胞核染色后偏向紫色，而細(xì)胞質(zhì)不著色。⑤染色的時(shí)長：甲基綠易進(jìn)入細(xì)胞使細(xì)胞核染色，對(duì)細(xì)胞質(zhì)的染色則很淺；吡羅紅進(jìn)入細(xì)胞的速率相對(duì)較慢，對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色較深，但也會(huì)與細(xì)胞核結(jié)合，染色時(shí)間過長易使細(xì)胞核偏向藍(lán)紫色。⑥兩種染料的配比：若吡羅紅比例偏高，則細(xì)胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核偏向紫色；若吡羅紅比例偏低，則細(xì)胞質(zhì)著色很淺，只有適當(dāng)?shù)臐舛群团浔炔拍茉谌旧笫辜?xì)胞核呈綠色，細(xì)胞質(zhì)及核仁呈紅色。但因購置的藥劑純度通常不同（甚至未標(biāo)注純度），使得不同文獻(xiàn)給出的試劑配比有較大差別，如陳小輝的《洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞中DNA和RNA染色方法的改進(jìn)》。此外，甲基綠和吡羅紅在配制過程中都存在較多不溶解的雜質(zhì)，需要過濾后再使用，使得所配制的溶液實(shí)際濃度更加難以確定，故教師在實(shí)驗(yàn)前需要先做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定合適配比。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以0.15%的甲基綠和2%的吡羅紅混合染色劑，染色1～2min，效果較好，酸解后染色，細(xì)胞核呈藍(lán)色；如果不酸解直接染色，細(xì)胞核常呈綠色或藍(lán)綠色，最接近教材效果（如圖5和圖6所示）。

圖5 酸解后，0.15%的甲基綠，2%的吡羅紅混合染色

圖6 不酸解，0.15%的甲基綠，2%的吡羅紅混合染色

圖7 酸解后，先用0.15%的甲基綠染色，再用2%的吡羅紅染色

圖8 酸解后，先用0.15%的甲基綠染色，再混合染色

沈曉蜜在《對(duì)“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”實(shí)驗(yàn)的幾點(diǎn)思考》中指出，本實(shí)驗(yàn)也可以采用分染法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，先用一種染料染色后，再用另一種染料覆蓋染色，細(xì)胞質(zhì)顏色先被置換，隨后細(xì)胞核顏色變成兩種染料的混合色。將材料酸解后，先用0.15%的甲基綠染色 3min，利用緩沖液洗去浮色，再用2%吡羅紅染色30s左右，立即將吡羅紅吸去，洗去浮色，效果也較好，并且可以觀察到核仁被染成紅色（如圖7所示）；若材料不經(jīng)酸解，吡羅紅染色時(shí)間需延長至3～4min。調(diào)換染色順序，細(xì)胞質(zhì)先被置換成綠色，細(xì)胞核卻仍是紅色，隨染色時(shí)間延長慢慢向藍(lán)紫色變化，說明吡羅紅與細(xì)胞核結(jié)合較緊密，較難被甲基綠置換。實(shí)驗(yàn)中，材料經(jīng)酸解后，先用0.15%的甲基綠染色3min，再以0.15%的甲基綠和2%的吡羅紅混合染色劑染色2min，效果也很好（如圖8所示）。

混合染色或分染時(shí)，若細(xì)胞質(zhì)呈明顯紫色，細(xì)胞核常呈偏藍(lán)色或藍(lán)紫色，究其原因：甲基綠進(jìn)入細(xì)胞較快，先結(jié)合細(xì)胞核使之呈綠色，但隨著染色時(shí)間延長，吡羅紅進(jìn)入細(xì)胞后容易與甲基綠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DNA，而使細(xì)胞核逐漸從綠色變換成藍(lán)色，進(jìn)而呈藍(lán)紫色或紫色。鹽酸水解可以使染色劑更易進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞染色均勻，而吡羅紅也可快速進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞核結(jié)合，使細(xì)胞核呈藍(lán)色。

4.兩種染液染色機(jī)理探析

人教版高中生物教材在“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”實(shí)驗(yàn)中給出甲基綠、吡羅紅染色原理：“甲基綠和吡羅紅兩種染色劑對(duì)DNA和RNA的親和力不同，甲基綠使DNA呈現(xiàn)綠色，吡羅紅使RNA呈現(xiàn)紅色。利用甲基綠、吡羅紅混合染色劑將細(xì)胞染色，可以顯示DNA和RNA在細(xì)胞中的分布?！苯滩闹兄皇翘岬絻煞N染色劑與DNA和RNA的親和力不同，但師生卻容易誤認(rèn)為甲基綠僅能與DNA結(jié)合使其呈現(xiàn)綠色，吡羅紅僅能與RNA結(jié)合使其呈現(xiàn)紅色。

從分子結(jié)構(gòu)分析，DNA和RNA中含堿基和磷酸基團(tuán)，堿基上一些含孤對(duì)電子的N或其他基團(tuán)可以接受質(zhì)子或釋放質(zhì)子，從而帶正電或負(fù)電；核苷酸鏈末端的磷酸基團(tuán)可以兩步解離，釋放兩個(gè)質(zhì)子，其余絕大多數(shù)的磷酸基團(tuán)只存在一步解離，因釋放出一個(gè)質(zhì)子而帶負(fù)電，故在水溶液中核酸可以看作是兩性電解質(zhì)。磷酸基團(tuán)的酸性較堿基的堿性強(qiáng)，故核酸通常表現(xiàn)為酸性（帶負(fù)電荷），容易與帶正電荷的堿性染料以離子鍵或氫鍵的形式相結(jié)合。DNA的磷酸基團(tuán)排列在雙螺旋結(jié)構(gòu)的外側(cè)，更容易電離而帶負(fù)電荷；RNA除了因磷酸基團(tuán)容易電離帶負(fù)電荷外，其堿基也常暴露在外，解離后而帶正電或負(fù)電。由于DNA和RNA的堿基組成、結(jié)構(gòu)以及分子大小不同，兩者的等電點(diǎn)不同，在同一種pH溶液中的帶電性也有所不同。

甲基綠和吡羅紅的發(fā)色基團(tuán)均為醌基，電離后帶一個(gè)正電荷，故甲基綠、吡羅紅都為堿性染料。兩者都能與DNA及RNA結(jié)合，只是親和力有所不同。甲基綠和吡羅紅混合染色時(shí)分別與DNA和RNA特異性結(jié)合可能與DNA和RNA不同的聚合度有關(guān)。在合適的pH條件下（約為4.8）混合染色時(shí)，兩種染料與核酸的結(jié)合有競(jìng)爭(zhēng)作用，甲基綠易與聚合程度高、負(fù)電性強(qiáng)的DNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，呈現(xiàn)綠色或藍(lán)綠色，而吡羅紅則易與聚合程度較低、負(fù)電性相對(duì)較弱的RNA（核仁、細(xì)胞質(zhì)中的RNA）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，呈現(xiàn)紅色，此外解聚的DNA也能與吡羅紅結(jié)合呈現(xiàn)紅色或紫色。若鹽酸解離過度或材料不夠新鮮，導(dǎo)致DNA降解，也易使細(xì)胞核呈紫色。

結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)效果驗(yàn)證，DNA與RNA都可以與甲基綠結(jié)合而呈綠色或都可以與吡羅紅結(jié)合呈紅色。例1中試題的相關(guān)選項(xiàng)的觀點(diǎn)有待商榷。另外，細(xì)胞核中DNA的量多而密集，故甲基綠、吡羅紅單獨(dú)染色時(shí)，細(xì)胞核都易被染成較深的綠色或紅色，在顯微鏡下很容易觀察。

5.實(shí)驗(yàn)結(jié)論與教學(xué)建議

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖抢眉谆G和吡羅紅對(duì)DNA和RNA的親和力差異，以顯示DNA和RNA在細(xì)胞中的分布，由于甲基綠和吡羅紅對(duì)DNA和RNA染色僅僅是親和力差異，但特異性結(jié)合不強(qiáng)，所以在實(shí)際操作中細(xì)胞核容易出現(xiàn)兩種顏色混合的現(xiàn)象，難以達(dá)到較好的實(shí)驗(yàn)效果。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，教師可以順勢(shì)引導(dǎo)學(xué)生深入探討相關(guān)原理，鼓勵(lì)學(xué)生進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析和探究，將簡(jiǎn)單的重復(fù)驗(yàn)證教材實(shí)驗(yàn)變?yōu)槿の缎?、科學(xué)性更強(qiáng)的探究性活動(dòng)，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維和科學(xué)探究能力，這也順應(yīng)了高考注重科學(xué)探究素養(yǎng)的考查，促進(jìn)學(xué)生學(xué)核心素養(yǎng)的養(yǎng)成。