芫花素對(duì)大鼠離體子宮收縮作用的研究

樊江波，張格林，徐珂

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710004；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，西安 710004；3.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710091)

益母草為唇形科、益母草屬植物，是中國(guó)傳統(tǒng)中藥，在我國(guó)已經(jīng)有數(shù)千年的使用歷史。益母草成分復(fù)雜，由于檢測(cè)和分析技術(shù)的不斷提高，對(duì)其成分的研究中不斷有新的化合物被發(fā)現(xiàn)。目前從益母草屬植物中分離得到的不同種類的化合物大約有140余個(gè)，并且還有許多化合物有待發(fā)現(xiàn)，這些已發(fā)現(xiàn)的化合物分別屬于二萜類、黃酮類、苯乙醇苷類、有機(jī)酸類、生物堿類、環(huán)形多肽類等[1]。

Fan等[2]首次用SD大鼠子宮平滑肌細(xì)胞來(lái)制作細(xì)胞膜色譜柱，用十通閥聯(lián)合細(xì)胞膜色譜(CMC)柱結(jié)合高效液相色譜/質(zhì)譜(HPLC/MS)系統(tǒng)[3]，進(jìn)行藥物活性成分分析。通過(guò)SD大鼠子宮平滑肌CMC-online-HPLC/MS二維聯(lián)用的方法鑒定出在大鼠子宮平滑肌細(xì)胞膜柱上有保留的丙酮萃取部位中的活性化合物為芫花素。為進(jìn)一步了解芫花素的藥理活性，本文考察了芫花素對(duì)大鼠離體子宮收縮的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)備

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性SD大鼠(8周齡，批號(hào)：SCXK(陜)2012-003)20只，體重180～220 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2.儀器：HW-400E恒溫平滑肌槽、BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技)；多腔肌動(dòng)描記器系統(tǒng)(Danish Myo Technology A/S，Skejbyparken，丹麥)；麥?zhǔn)显〔?寧波雙嘉儀器)；張力換能器(上海欣曼科教設(shè)備)。

3.試劑：芫花素(純度>98.5%，云南西麗生物技術(shù))；戊酸雌二醇(DELPHARM Lille S.A.S，法國(guó))；縮宮素(甘肅大得利制藥)；洛氏液(NaCl 154.0 mmol/L、KCl 5.63 mmol/L、CaCl22.16 mmol/L、NaHCO31.19 mmol/L、葡萄糖5.55 mmol/L)(廣東光華科技)、Krebs緩沖液(NaCl 118.0 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、葡萄糖11.1 mmol/L，pH 7.2～7.4)(實(shí)驗(yàn)室自制)。

二、方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥：20只雌性大鼠隨機(jī)分為4組，每組5只，分別為：縮宮素組(0.002 U/ml)、芫花素1.5 μg/ml(小劑量)、芫花素3 μg/ml(中劑量)和芫花素6 μg/ml(大劑量)組。實(shí)驗(yàn)前48 h，每鼠以133 μg/kg戊酸雌二醇灌胃，1次/d，連續(xù)2 d，使動(dòng)物處于動(dòng)情前期。

2.芫花素劑量確定：根據(jù)芫花素半數(shù)有效濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出芫花素收縮大鼠離體子宮的半數(shù)有效濃度pEC50約為2×10-6mol/L，并且芫花素濃度在1×10-6mol/L到1×10-5mol/L范圍內(nèi)，對(duì)離體子宮條的收縮作用變化不大，從36.91%到62.45%不等。為觀察到確切藥效，我們?cè)诤罄m(xù)的離體實(shí)驗(yàn)中選擇劑量稍大的10-5mol/L為中劑量。芫花素分子量為284.263，10-5mol/L的芫花素即為2.84 μg/ml，為方便配制藥品和計(jì)算，我們將中劑量定為3 μg/ml，小劑量減半為1.5 μg/ml，而大劑量加倍為6 μg/ml。

3.芫花素半數(shù)有效濃度(EC50)測(cè)定：大鼠麻醉后斷頭處死，將大鼠子宮的雙角縱向切分成約1 cm長(zhǎng)條，將大鼠子宮平滑肌條安裝在多腔肌動(dòng)描記器系統(tǒng)上。子宮平滑肌條維持在37℃ Krebs緩沖液(pH 7.4)中，通入95% O2和5% CO2的混合氣體，將子宮平滑肌條初始張力調(diào)節(jié)為3 mN，每20 min用Krebs緩沖液沖洗組織一次，共平衡60 min。用LabChart記錄子宮平滑肌條的收縮。收縮振幅帶記錄10 min以上。在浴槽內(nèi)分別加入芫花素(10-7～10-4mol/L)和縮宮素(10-7～10-4mol/L)，每個(gè)濃度記錄15 min。由于有自發(fā)性收縮活力的子宮平滑肌條只有短暫的活力(約2～3 h)，每一子宮平滑肌條只被用于一個(gè)藥物濃度。

4.芫花素對(duì)離體子宮平滑肌的影響：大鼠麻醉后斷頭處死，迅速剪開(kāi)腹腔，輕輕剝離子宮周?chē)窘M織，絲線結(jié)扎子宮陰道端，剪取2 cm子宮，置于盛有洛氏液的平皿內(nèi)，清除殘留結(jié)締組織和脂肪。將離體子宮陰道端固定于麥?zhǔn)显〔壑械腖型通氣鉤上，另端與張力換能器相接，麥?zhǔn)显〔蹆?nèi)加60 ml洛氏液，不斷充氧，保持水浴恒溫37±0.5℃，每20 min更換一次新鮮營(yíng)養(yǎng)液。用BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)先記錄一段正常曲線后，分別加入縮宮素0.2 U/ml、芫花素0.15 mg/ml(小劑量)、芫花素0.3 mg/ml(中劑量)、芫花素0.6 mg/ml(大劑量)，給藥容積0.6 ml，則浴槽內(nèi)藥物終濃度為：縮宮素0.002 U/ml、芫花素1.5 μg/ml(小劑量)、芫花素3 μg/ml(中劑量)、芫花素6 μg/ml(大劑量)。空白對(duì)照組浴槽中加入等體積生理鹽水。

5.檢測(cè)指標(biāo)：觀察給藥前后子宮收縮幅度變化。芫花素和縮宮素引起的子宮平滑肌條的收縮反應(yīng)由收縮振幅(%)衡量。收縮振幅(%)=給藥后的子宮平滑肌條收縮振幅/給藥前的子宮平滑肌條收縮振幅× 100%。

三、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、芫花素半數(shù)有效濃度(EC50)

在芫花素和縮宮素藥物濃度分別為10-7～10-4mol/L時(shí)，用芫花素和縮宮素引起的子宮肌條的收縮振幅(%)來(lái)表示芫花素和縮宮素對(duì)大鼠離體子宮肌條自發(fā)收縮的影響。結(jié)果表明，芫花素和縮宮素均可誘導(dǎo)子宮肌條的收縮，且二者對(duì)大鼠離體子宮肌條收縮振幅(%)的影響無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 芫花素和縮宮素對(duì)大鼠離體子宮平滑肌條自發(fā)收縮振幅的影響[n=10，(-±s)]

二、芫花素對(duì)大鼠離體子宮影響

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，縮宮素對(duì)大鼠離體子宮平滑肌的收縮值和舒張值均有一定的增強(qiáng)作用，給藥前后比較，有顯著性差異(P<0.01)；芫花素各組對(duì)大鼠離體子宮平滑肌的收縮值和舒張值均有一定的增強(qiáng)作用，給藥前后比較，有顯著性差異(P<0.01)；芫花素小劑量組對(duì)大鼠離體子宮平滑肌的收縮值、舒張值的增強(qiáng)作用較縮宮素弱，與縮宮素比較，有顯著性差異(P<0.01)；芫花素中、大劑量組對(duì)大鼠離體子宮平滑肌的收縮值、舒張值的增強(qiáng)作用與縮宮素相當(dāng)，均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2、圖1)。

組 別劑量收縮值(mN)舒張值(mN)給藥前給藥后增加值給藥前給藥后增加值空白對(duì)照組-0.98±0.481.03±0.570.05±0.010.49±0.280.53±0.170.04±0.01縮宮素組0.002 U/ml0.74±0.362.03±0.67*1.28±0.05#0.51±0.151.59±0.56*1.07±0.21#芫花素小劑量組1.5 μg/ml1.03±0.321.42±0.310.38±0.04#0.78±0.311.01±0.430.30±0.14#芫花素中劑量組3 μg/ml1.40±0.252.20±0.52*0.98±0.06#0.99±0.391.75±0.50*0.76±0.18#芫花素大劑量組6 μg/ml1.06±0.362.01±0.42*0.95±0.06#0.70±0.311.48±0.38*0.78±0.25#

注：與相應(yīng)劑量組給藥前比較，*P<0.01；與空白對(duì)照組比較，#P<0.01

A：縮宮素組；B：芫花素小劑量組；C：芫花素中劑量組；D：芫花素大劑量組圖1 藥物對(duì)大鼠離體子宮收縮作用曲線

討 論

中國(guó)藥學(xué)著作《本草綱目》中稱益母草為“血家之圣藥”。近年來(lái)的一些研究表明，益母草具有增加子宮收縮振幅、頻率和張力[4]、緩解痛經(jīng)[5]、在休克狀態(tài)下改善微血管血液灌注[6]、溶解血塊[7]、減少抗自由基[8]、治療心肌缺血[9]和增強(qiáng)免疫力[10]等藥理作用。益母草目前臨床應(yīng)用較為廣泛，在婦產(chǎn)科臨床上已經(jīng)普遍用于預(yù)防和治療產(chǎn)后出血、產(chǎn)后子宮復(fù)舊不良、惡露不凈、痛經(jīng)及功血等疾病。

在產(chǎn)科臨床工作中，產(chǎn)后出血是世界衛(wèi)生組織公布的世界孕產(chǎn)婦四大死亡原因之首。產(chǎn)后出血的主要原因又分為子宮因素、胎盤(pán)因素、產(chǎn)道軟組織損傷和凝血機(jī)制障礙紊亂等四大類[11-13]，其中最常見(jiàn)的原因是子宮收縮乏力等子宮因素引起的出血。藥物治療產(chǎn)后出血主要有縮宮素、麥角新堿、前列腺素衍生物、鈣、抗利尿激素和止血?jiǎng)┑萚14-16]?？s宮素是最常用于產(chǎn)后出血的預(yù)防和治療的藥物，但縮宮素有一定的局限性，對(duì)子宮平滑肌作用弱，半衰期短，受體易于飽和[17]。因此，需要不斷開(kāi)發(fā)新的藥物來(lái)治療產(chǎn)后出血。

目前對(duì)益母草的研究廣泛，發(fā)現(xiàn)益母草可以促進(jìn)子宮收縮，已有學(xué)者將其用于治療產(chǎn)后出血[18-20]。趙丁等[21]采用小鼠體外子宮標(biāo)本，以生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄益母草水提物(0.5～4.0 mg/ml)對(duì)子宮收縮頻率及幅度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示益母草水提物可顯著加快產(chǎn)后小鼠子宮收縮的頻率并增強(qiáng)子宮的活動(dòng)力。石米揚(yáng)等[22]研究發(fā)現(xiàn)益母草水煎劑可明顯刺激小鼠離體子宮收縮，并且發(fā)現(xiàn)這種作用可能與刺激子宮的H1受體和α腎上腺素能受體有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究了芫花素對(duì)大鼠離體子宮平滑肌的影響，發(fā)現(xiàn)芫花素中、大劑量對(duì)大鼠離體子宮平滑肌的收縮值、舒張值均有一定的增強(qiáng)作用，給藥前后比較，有顯著性差異(P<0.01)且與縮宮素相比效果相當(dāng)(P>0.05)。說(shuō)明芫花素有顯著增強(qiáng)大鼠離體子宮的收縮作用，且中大劑量時(shí)與縮宮素的作用相當(dāng)，所以，芫花素的子宮收縮藥理作用具有潛在的臨床應(yīng)用前景。