MTHFR基因多態(tài)性在臺(tái)州地區(qū)原發(fā)性男性不育癥中的研究

徐佳佳，陳文舉，梁玲芝，樓永良

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，溫州 325000；2.臺(tái)州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，臺(tái)州 318000)

目前全世界約有10%～15%的育齡夫婦不育，其中男性因素占50%[1-2]。男性不育病因復(fù)雜，遺傳因素是原發(fā)性男性不育的主要原因之一。5，10亞甲基四氫葉酸還原酶 (Methylene tetrahydrofolate reductases，MTHFR)基因位點(diǎn)多態(tài)性成為女性不孕的研究熱點(diǎn)[3-4]，而在男性不育中研究較少。MTHFR是葉酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，突變可造成體內(nèi)嘌呤嘧啶合成異常及DNA、RNA甲基化異常，造成發(fā)育必須的DNA及蛋白質(zhì)缺陷，因此可導(dǎo)致精子數(shù)量、活力、形態(tài)等異常，從而發(fā)生受精困難或質(zhì)量低下受精卵形成[5-6]。本文旨在探討MTHFR基因C677T和A1298C位點(diǎn)多態(tài)性與原發(fā)性男性不育的關(guān)系。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2018年1～7月在臺(tái)州市中心醫(yī)院就診的的原發(fā)性男性不育患者104例，年齡20～54歲；選取同期健康查體的已育男性108例為對(duì)照組，年齡19～44歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)[7]：(1) 原發(fā)性不育組為至少1年未避孕且從未使其配偶妊娠的男性，不育年限1～4年，每例均進(jìn)行詳細(xì)的病史采集和生殖?？茩z查，排除引起男性不育的其他因素，如隱睪、尿道下裂、精索靜脈曲張、染色體異常、性腺發(fā)育不全等；女性配偶檢查正常，排除其相關(guān)的不育因素，包括婦科檢查、B超和子宮輸卵管造影檢查、女性生殖內(nèi)分泌激素的檢測(cè)；(2)正常生育對(duì)照組為男性生殖?？茩z查正常、并在近3年育有健康小孩的男性；(3)女性配偶年齡<36歲。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)：采集不育組和對(duì)照組男性1～2 ml外周血，EDTA抗凝。用DNA提取試劑盒 (TIANamp Blood DNA Kit DP318，北京天根生化)提取DNA，應(yīng)用ABI Stepone Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國(guó))、MTHFR基因檢測(cè)試劑盒(江西諾德)進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)MTHFRC677T和A1298C位點(diǎn)的基因多態(tài)性。引物系列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增程序：95℃總變性5 min，95℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

表1 MTHFR目的基因引物及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。

結(jié) 果

一、一般資料

參與本研究的104例患者年齡20～54歲，平均年齡(31.56±4.81)歲，為常住6年以上的臺(tái)州居民，其中農(nóng)民21%，工人36%，事業(yè)單位人員和公務(wù)員43%。所有患者均無(wú)隱睪、尿道下裂、精索靜脈曲張、染色體異常、性腺發(fā)育不全等，所有患者常規(guī)體檢均正常。對(duì)照組為健康查體的108例已育男性，年齡19～44歲，平均年齡(30.58±4.43)歲。

二、MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率比較

原發(fā)性男性不育組CC、CT、TT型基因頻率分別為34.62%、42.31%和23.08%，TT基因型在原發(fā)性男性不育組中分布頻率顯著升高，同時(shí)CC基因型在原發(fā)性男性不育組中表達(dá)頻率顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，T等位基因頻率在原發(fā)性男性不育組中顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，相對(duì)于純合未突變等位基因C 的相對(duì)危險(xiǎn)度OR1.313[95%CI(1.029，1.674)](表2)。

三、MTHFR基因A1298C位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率比較

男性不育組與正常對(duì)照組相比，其MTHFR基因A1298C位點(diǎn)基因型頻率構(gòu)成比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；男性不育組的C等位基因頻率與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表2 MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因頻率比較[n(%)]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

表3 MTHFR基因A1298C位點(diǎn)基因頻率比較[n(%)]

討 論

MTHFR是葉酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，MTHFRC677T 突變位點(diǎn)在第4 外顯子 677位點(diǎn)上，一個(gè)胞嘧啶C變異成為一個(gè)胸腺嘧啶T，是目前發(fā)現(xiàn)的MTHFR基因最常見(jiàn)的不耐熱錯(cuò)義突變，可導(dǎo)致酶活性降低。MTHFR基因另一常見(jiàn)多態(tài)性 A1298C在調(diào)節(jié)區(qū)的第7外顯子上，A1298C 突變是由胞嘧啶C替代腺嘌呤A，不影響酶的催化活性，主要使酶的調(diào)節(jié)活性受影響[8]。

MTHFR基因突變可造成葉酸代謝障礙，體內(nèi)嘌呤嘧啶合成異常及DNA、RNA甲基化異常，造成發(fā)育必須的DNA及蛋白質(zhì)缺陷，在男性易引起精子缺陷。受精過(guò)程中，DNA缺陷的精子不易被卵母細(xì)胞的透明帶自然識(shí)別，造成受精率低下。DNA損傷的精子進(jìn)人卵子后，其染色質(zhì)去致密化過(guò)程出現(xiàn)障礙，妨礙雄性原核的形成，可導(dǎo)致受精失敗。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，突變基因可使受精卵發(fā)育異常，從而導(dǎo)致受精卵著床不穩(wěn)、胚胎發(fā)育異常、 胎兒畸形或胚胎發(fā)育停止、流產(chǎn)等。此外，MTHFR基因突變可導(dǎo)致體內(nèi)具有細(xì)胞毒性的同型半胱氨酸(Hcy)水平增高，高Hcy血癥代謝過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，從而使精子核與線粒體DNA損傷，影響精子功能[9]。鄒宇潔等[10]研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性可影響精子活力、存活率、DNA完整性及頂體完整性，從而使精子質(zhì)量下降，導(dǎo)致原發(fā)性男性不育的發(fā)生。

本研究顯示，臺(tái)州地區(qū)MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型與等位基因分布與原發(fā)性男性不育相關(guān)(χ2=6.975，P<0.05)。MTHFR基因C677T位點(diǎn)T等位基因在原發(fā)性男性不育組中分布頻率顯著高于對(duì)照組，T等位基因是原發(fā)性男性不育的危險(xiǎn)因素[OR1.313，95%CI(1.029，1.674)]。MTHFR基因A1298C位點(diǎn)基因型與原發(fā)性男性不育無(wú)相關(guān)性(χ2=0.108，P>0.05)。這與Mfady等[11]研究的約旦人MTHFR基因C677T位點(diǎn)與男性不育有顯著相關(guān)、A1298C位點(diǎn)基因型與男性不育無(wú)顯著相關(guān)，Wu等[12]研究的亞洲人C677T突變易發(fā)生男性不育而A1298C位點(diǎn)則無(wú)明顯影響相一致；與胡斐等[13]研究的C677T 多態(tài)性可能與男性少弱精子癥的發(fā)生相關(guān)相似；但與周生輝等[14]、馬芳芳等[15]研究的MTHFR基因C677T多態(tài)性與男性不育無(wú)顯著相關(guān)不同。另一些研究報(bào)告也顯示各種基因型在不育男性和對(duì)照組的分布并無(wú)差異，認(rèn)為C677T與男性不育無(wú)關(guān)[16-17]。這可能與MTHFR基因位點(diǎn)多態(tài)性存在一定的地域差異有關(guān)。本文研究對(duì)象為常住6年以上的臺(tái)州地區(qū)部分原發(fā)性不育男性，具有一定的地域局限性，代表性欠佳，因而MTHFR基因型及等位基因頻率結(jié)果可能存在一定的偏差。今后將進(jìn)行大樣本量研究，使數(shù)據(jù)更接近真實(shí)情況。

通過(guò)本研究顯示，檢測(cè)育齡男性MTHFR基因位點(diǎn)多態(tài)性，與檢測(cè)育齡女性MTHFR基因位點(diǎn)多態(tài)性同樣具有意義?？筛鶕?jù)基因結(jié)果進(jìn)行個(gè)體化葉酸補(bǔ)充指導(dǎo)，改善精子結(jié)構(gòu)和功能，減少原發(fā)性男性不育的發(fā)生。